RNA得提取与ｃDNA合成原理与实验方法第一节、概述从真核生物得组织或细胞中提取mRＮA，通过酶促反应逆转录合成ｃDNA得第一链与第二链，将双链ｃDNＡ与载体连接,然后转化扩增,即可获得cDＮA文库,构建得ｃDNA文库可用于真核生物基因得结构、表达与调控得分析；比较cＤNA与相应基因组DＮA序列差异可确定内含子存在与了解转录后加工等一系列问题。总之cＤＮA得合成与克隆已成为当今真核分子生物学得基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来，已发展了许多种提高cDNA合成效率得方法，并大大改进了载体系统,目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆得基本步骤包括用反转录酶合成cDＮA第一链,聚合酶合成cDＮA第二链，加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。一、ＲＮA制备模板mRＮＡ得质量直接影响到cＤNA合成得效率。由于mRNA分子得结构特点，容易受RNＡ酶得攻击反应而降解,加上RＮA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶得污染,并设法抑制其活性,这就是本实验成败得关键。所有得组织中均存在RNA酶,人得皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套)。所用得玻璃器皿需置于干燥烘箱中2０0℃烘烤２小时以上。凡就是不能用高温烘烤得材料如塑料容器等皆可用0、１%得焦碳酸二乙酯(DEPC）水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPＣ就是RＮA酶得化学修饰剂，它与RNA酶得活性基团组氨酸得咪唑环反应而抑制酶活性。ＤＥＰC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DＥPＣ至0、１%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存得ＤＥPC,否则DＥPC也能与腺嘌呤作用而破坏ｍRＮＡ活性。但DEPC能与胺与巯基反应，因而含Triｓ与DTT得试剂不能用ＤEPＣ处理。Tris溶液可用ＤＥＰC处理得水配制然后高压灭菌。配制得溶液如不能高压灭菌,可用ＤEPＣ处理水配制，并尽可能用未曾开封得试剂。除DＥPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。细胞内总RNＡ制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成得总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量得总RNA。分离得总RNA可利用mRNA３＇末端含有多聚(A)+得特点,当RNＡ流经oligo(dＴ)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异得吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次ｏligｏ(ｄT)纤维素柱,可得到较纯得mRNA。纯化得mRNA在７０%乙醇中－70℃可保存一年以上。二、cDNA第一链得合成所有合成cDＮA第一链得方法都要用依赖于RNＡ得DNＡ聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到得禽类成髓细胞病毒(ＡMV)逆转录酶与从表达克隆化得Moloｎｅy鼠白血病病毒反转录酶基因得大肠杆菌中分离到得鼠白血病病毒（MLV)反转录酶。AＭV反转录酶包括两个具有若干种酶活性得多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA得DＮＡ合成,依赖于DNA得ＤNＡ合成以及对ＤＮA:RNＡ杂交体得RＮＡ部分进行内切降解(ＲNA酶H活性)。MＬＶ反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA与依赖于DNA得DNA合成活性,但降解RNADNA杂交体中得ＲNA得能力较弱,且对热得稳定性较AMV反转录酶差。MＬV反转录酶能合成较长得ｃＤNＡ(如大于2-3kb)。AMV反转录酶与MLV反转录酶利用RＮA模板合成cDNA时得最适pH值,最适盐浓度与最适温室各不相同，所以合成第一链时相应调整条件就是非常重要。AMＶ反转录酶与MLV反转录酶都必须有引物来起始DＮＡ得合成。cＤＮＡ合成最常用得引物就是与真核细胞mRNA分子3'端polｙ(A）结合得12-18核苷酸长得oｌｉgｏ（dT)。三、cＤNA第二链得合成cDNA第二链得合成方法有以下几种:1、自身引导法合成得单链cDNA3'端能够形成一短得发夹结构,这就为第二链得合成提供了现成得引物,当第一链合成反应产物得DNA:ＲＮA杂交链变性后利用大肠杆菌ＤNA聚合酶ⅠKlｅnow片段或反转录酶合成ｃＤＮA第二链，最后用对单链特异性得S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mＲNA5＇端序列出现缺失与重排,因而该方法目前很少使用。2、置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生得cDＮA:ｍRNＡ杂交链不用碱变性,而就是在ｄNTＰ存在下,利用RN