病毒RNA提取实验材料微量移液器（1mL、200μL）DEPC水处理过的枪头、EP管Trizol试剂氯仿异丙醇75%乙醇（用DEPC水配制）实验原理在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5gRNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。实验方法RNA提取1.匀浆处理:a.组织将组织在匀浆器中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTrizol，用匀浆仪进行匀浆处理（为防止组织RNA降解，可在液氮中研磨。样品体积不应超过Trizol体积10℅）。b.单层培养细胞直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c.细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTrizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。注意：对于病毒RNA的提取，可将组织在匀浆器中加入DMEM培养基或PBS磨碎后12000rpm离心10min，取200ml上清移至新的EP管中，加入1mlTrizol充分混匀，室温放置5min后再进行第4步操作。将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉）可于4℃12000rpm离心10min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4.每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，冰浴10min。(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)5.4℃12000rpm离心5min。样品分为三层：底层为蓝色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。6.把600μl水相转移到新管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。（异丙醇作用为沉淀RNA）7.4℃12000rpm离心10min，弃上清。（离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀）8.加入1mL75℅乙醇洗涤RNA沉淀。4℃7600rpm离心5min，用枪头吸尽残存的乙醇。9.打开离心管管盖，室温放置干燥，使残存的痕量乙醇挥发殆尽。（不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。）加20~50μlDEPC水溶解（提好的RNA最好要立即使用，如不使用应尽快放入-80℃保存）。检测RNA的浓度和纯度若OD260/OD280大于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品；若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。注意事项匀浆后加氯仿之前样品可在-60～-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5--20℃一年以上。2.预防RNase污染措施：经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。使用DEPC水处理过的RNA专用塑料制品避免交叉污染。RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料器皿。配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌）。