一、实验目的及背景而研究的起点就是要获得纯度高－－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－－以便用于以后ＰＣＲ（链式酶聚合反应）分析，RFLP（限制性片段长度）分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。基因组DNA的获得是进行基因结构和功能研究的重要步骤,基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP—restrictionfragmentlengthpolymorphism)及PCR分离基因等。二、DNA提取的几种方法真核生物基因组DNA为双链线性分子，存在于细胞核内。基因组DNA的提取过程包括：DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离、DNA的沉淀等过程。分离纯化核酸的总原则：1.保证核酸一级结构的完整性；2.排除其它分子的污染，如：（1）对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；（2）生物大分子，如蛋白质、多糖和脂质；（3）其它核酸分子，如RNA。DNA提取流程图三、材料注意：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低四、细胞裂解的方法一、化学方法1、渗透压冲击：低渗环境可使某些细胞破碎2、增溶法：以表面活性剂增加细胞膜的水溶性。3、碱裂解法二、物理方法玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法三、生物方法酶解法：溶菌酶可用于细菌的破碎注：根据不同的实验要求选取不同的细胞破碎方式，应当保证要提取的物质不受损伤SDS，十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；注意：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞/血液－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠五、分离及纯化的常用方式注意：针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法1、蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理a.SDS及蛋白酶K可有效的使DNA与蛋白质解离。b.盐析：中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。中和蛋白质分子所带电荷破坏蛋白质分子周围的水化膜六、真核细胞基因组提取的步骤：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。盐离子的去除：70％的乙醇洗涤DNA的沉淀：注意：当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入饱和NaCL，有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA的定量DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。DNA碱基对的平均分子量=650道尔顿A260unitdsDNA=50µg/ml=0.15mM(innucleotides)A260unitssDNA=33µg/ml=0.10mM(innucleotides)A260unitssRNA=40µg/ml=0.11mM(innucleotides)七、注意事项八、本实验的操作过程5、于离心管中加入80μl饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为1.2mol/L），混匀。5,000rpm离心10分钟。（沉淀蛋白质）6、小心吸取上清液约240μl转移至另一洁净的1.5mlEppendorf离心管中。加入750μl95％的冷乙醇（终浓度为71％），－20℃放置30min。离心1,1000rpm×10分钟，最好在4℃。（沉淀DNA）7、小心吸去上清，加入1.0ml75％的冷乙醇，洗涤沉淀，离心1,1000rpm×5分钟。（脱盐）8、弃去上清，置37℃温箱中干燥，以去除残余的乙醇。9、将干燥后的DNA溶于50μl