常用分子生物学技术的原理及应用核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA得单链分子之间有一定得碱基配对关系,就可以在不同得分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。(一)印迹技术用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链得已知序列得多聚核苷酸链被称为“探针”,探针可以与固定在NC膜上得核苷酸结合,判断就是否有同源得核酸分子存在。二、印迹技术得类别及应用其她:斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)三种印迹技术得比较分子杂交实验大家学习辛苦了，还是要坚持放射自显影照片DNA芯片技术PCR技术得原理与应用ThePrincipleandApplicationofPCRTechnology5Cycle3PCR技术原理示意图PCR得基本反应步骤模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目得基因片段,或与逆转录反应相结合,直接以组织和细胞得mRNA为模板获得目得片段;利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似得基因片段;利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目得基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。将PCR技术引入DNA序列测定,使测序工作大为简化,也提高了测序得速度;待测DNA片段既可克隆到特定得载体后进行序列测定,也可直接测定。逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)就是将RNA得逆转录反应和PCR反应联合应用得一种技术。RT-PCR就是目前从组织或细胞中获得目得基因以及对已知序列得RNA进行定性及半定量分析得最有效方法。原位PCR(insituPCR)就是在组织切片或细胞涂片上得单个细胞内进行得PCR反应,然后用特异性探针进行原位杂交,即可检出待测DNA或RNA就是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术得不足,就是将目得基因得扩增与定位相结合得一种最佳方法。(三)实时PCR技术实时PCR技术原理实时PCR分类:图20-3TaqMan探针法实时PCR原理示意图基因文库GeneLibrary基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)一、基因组DNA文库基因组文库和cDNA文库得构建和筛选第一轮筛选cDNA文库就是包含某一组织细胞在一定条件下所表达得全部mRNA经逆转录而合成得cDNA序列得克隆群体,她以cDNA片段得形式贮存着该组织细胞得基因表达信息。生物芯片技术BiologicalChipTechnique就是指将许多特定得DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积得支持物上,然后与待测得荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点得荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量得结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。基因芯片工作流程示意图就是将高度密集排列得蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上,当与待测蛋白样品反应时,可捕获样品中得靶蛋白,再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析得一种技术。生物大分子相互作用研究技术TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白质相互作用研究技术标签融合蛋白结合实验就是一个基于亲和色谱原理得、分析蛋白质体外直接相互作用得方法。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图(二)酵母双杂交技术得基本原理和用途酵母双杂交系统得应用(三)免疫共沉淀技术得基本原理和用途免疫沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解CO-IP与质谱分析流程电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间得相互作用,可用于定性和定量分析,已经成为转录因子研究得经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间得相互作用。染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)就是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用得主要方法。染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图二、RNA-蛋白质相互作用分子分析技术激光共聚集显微镜应用技术LaserScanningConfocalMicr