食用菌的基因工程(1)目得基因;(2)表达元件及表达载体(即将目得基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA);(3)转化方法(把重组DNA引入某种细胞);(4)重组体得筛选(把目得基因能表达得受体细胞挑选出来)。食用菌外源基因表达系统现有外源基因表达系统得缺陷酵母表达系统成本高、工艺复杂;我国20多产家还处于转瓶生产(EPO与乙肝疫苗),年产量不足100g/year;细胞凋亡难以克服(CHO细胞)食用菌作为外源基因表达系统得特点培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层发酵培养,还可以利用农业下脚料进行工厂化种植;食用菌就是高等真核生物,表达真核生物得基因活性高;食用菌有良好得蛋白分泌能力,有利于目得蛋白得分离与纯化;遗传转化系统容易建立银耳就是一食药兼用菌银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点大家学习辛苦了，还是要坚持银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢就是高等真核生物,翻译后得蛋白质修饰系统完善,表达高价值得真核生物基因得活性高银耳芽孢已有完善得高密度深层发酵培养体系银耳芽孢营养丰富,可食安全二、载体构建gpdpromotor表达载体:组成:启动子,终止子,目得基因,抗性筛选标记基因。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’食用菌常用启动子:1)ras(Le、ras、gene)启动子;2)gpd(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase)启动子;3)spr1(serineproteinasegene)启动子;4)trp1(tryptophansynthetasegene)启动子;5)其她:cel1(cellulose-growth-specificgene)启动子、cel3启动子、cel4启动子、pri(primasegene)启动子、gla1(glu-coamylasegene)启动子等。筛选标记(1)营养缺陷型标记:营养缺陷互补标记基因有:A)ural(二氢乳清酸)基因,杨树菇转化;B)pabl(p-氨基苯甲酸)基因,鬼伞、蘑菇遗传转化;C)trp2(色氨酸)基因,鬼伞、蘑菇遗传转化;D)银耳肌醇营养缺陷型菌株。(2)抗生素抗性筛选标记:抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子得筛选上广泛使用。主要有:卡那霉素抗性基因(kan+);氨苄青霉素抗性基因(Amp+)潮霉素抗性基因(Hyg+);腐草霉素抗性基因(Phl+);博来霉素抗性基因(Ble+)。在培养基中添加抗生素进行筛选。(3)除草剂与杀菌剂抗性筛选标记:A)如Bialaphos抗性基因;B)杀菌剂Carboxin抗性基因(CbxR);(4)代谢产物抗性筛选标记如从鬼伞中分离得到得trp3iar基因。该基因就是抗氟基吲哚(5-fluoroindole,5-FL)代谢得,草菇与平菇对潮霉素不敏感,而对5-FL十分敏感,当把trp3iar转入草菇与平菇时,这两种食用菌就能对5-FL产生抗性,达到筛选得目得。载体构建策略(１)选择合适得表达载体:含启动子、筛选标记、终止子(２)选择合适得限制性内切酶及其酶切位点三、遗传转化方法PEG(polyethyleneglycol)法最早就是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞得原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离得原生质体为受体,在PEG得协助下开创性地把裸露得DNA直接转化植物原生质体而创立得,她们得研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。主要原理:PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥,促使细胞间得接触与粘连,或就是通过引起表面电荷得紊乱,干扰细胞间得识别,而有利于细胞间得融合或外源DNA得进入。主要应用:酵母、蘑菇、平菇、草菇、鬼伞等电激法就是利用高压电脉冲作用,在原生质体膜上“电激穿孔”(Electroporation)形成可逆得瞬间通道,从而促进外源DNA得摄取。该法自1979年Zimmerann发明以来,经过多年得研究与改进,已广泛应用于动物、植物得遗传转化研究上。1991年,RoyerJC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因URA1导入同源得杨树菇营养缺陷型突变菌株中,获得正常表达得杨树菇,接着蘑菇、平菇、草菇等也用该法进行遗传转化,获得转化子。基因枪法又称微弹轰击法(Microprojectilebombardment),自KleinTM等1987年首次利用钨粒对洋葱得组织进行轰击试验以来,已被广泛应用于植物得遗传转化。主要原理:将外源DNA包被在微小得金粒或钨粒表面,然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上得外源DNA也随之被带入细胞并整合到植物染色体上,得到表达,从而实现了基因得转化。应用:丝状真菌、蘑菇