动物基因工程是利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。从遗传学角度分为：遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传。非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。第一节动物基因工程的发展状况与趋势35HBV转基因动物树鼩从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表达。基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位操作。大家有疑问的，可以询问和交流从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等５个方面。第二节转基因动物技术一、动物基因工程载体动物基因工程载体1.质粒型表达载体以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例2.病毒载体（1）腺病毒（adenovirus）（2）腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）AAV具有以下几个方面特点：非致病性、无免疫原性和无炎症反应能感染静止期的细胞，如神经元细胞插入的外源基因表达时间长，一般能够达到1年之多宿主范围广热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化（3）反转录病毒3.定向打靶载体（1）基因敲除（2）基因敲入（3）基因下调（knock-down）二、基因转移技术1.物理转染法图1.利用点穿孔法进行基因转移（2）显微注射法是将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。（3）基因枪法基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金属（钙或金等）颗粒上，在一种加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的（4）超声波法（sonoporation）超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外源基因进入细胞，提高基因的转染效果2.化学转染法图2.利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染图3.质脂体介导的基因转移（3）原生质体融合法含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺在单层培养的哺乳动物细胞上，在融和剂（如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转如细胞内，实现转基因构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩增鉴定；重组DBA分子通过物理或化学方法转入一个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体上，并表达外源基因。图4逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因第三节转基因动物制备一转基因动物的制备程序1、DNA显微注射法制备转基因小鼠显微注射技术2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠胚胎干细胞制备转基因动物过程胚胎干细胞基因转化法(引自G1ick&Pasternak，1998)判断是否是种系嵌合首先用转基因嵌合体的小鼠与正常的小鼠交配，对其后代进行检测，如果后代中有转基因个体出现，证明为种系嵌合，然后将转基因杂合子个体进行横交就会获得转基因纯合子和杂合子个体。如果在后代中没能发现转基因纯合子，应注意是否因为转基因的纯合造成了胚胎的早期死亡，无法得到成活个体所致。基因的准备二转基因鉴定三表达水平的检测1、报告基因报告基因是编码容易检测的蛋白质的核苷酸序列，一般用以替换难于测定的蛋白质基因，或制备融合蛋白，或利用IRES与目的蛋白形成一条mRNA序列，分别翻译出两种蛋白，来研究目的蛋白的功能及其表达特性。2、Northern杂交可以检测转基因动物或转染细胞是否转录出目的基因所对应的mRNA3、反转录PCR（RT-PCR）是将由mRNA反转录产