洛阳俸达医用包装材料有限公司GMP文件类别操作规程/5题目微生物限度检查法纯化水验证方案编号起草人审核人批准人日期日期日期颁发部门质量管理部生效日期制作备份分发部门QA室、QC室版本：1一概述本验证是对细菌，霉菌酵母菌计数项下检查法2薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证。细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。二目的建立该纯化水的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。三范围：纯化水四参加人员五内容5.1验证需用仪器设备：电热恒温培养箱、多用生化培养箱、蒸汽灭菌器5.2纯化水微生物限度检查质量标准项目标准规定细菌总数≤100个/ml霉菌、酵母菌5.3细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。6测试方法6.1供试品：制水间送水口纯化水《中国药典》2010年版二部微生物限度检查——薄膜过滤法6.2培养基及菌种6.2.1经适用性检查符合规定的培养基。6.2.2枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。6.3菌液制备6.3.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经32.5℃±2.5℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，经25.5℃±2.5℃培养24～48h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经25.5℃±2.5℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.4.细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验6.4.1供试品对照组：用灭菌注射器取少量PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液注入灭菌薄膜过滤器，润湿滤膜，再取充分混匀的纯化水样1ml注入滤器，再用适量的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，使总冲洗量为100ml,冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于已制备好的平板上，按菌落计数方法测定供试品本底菌数；细菌、霉菌及酵母菌各制备2个平皿。6.4.2菌液组：分别取上述5种试验菌悬液各1ml，分别注入平皿中，立即倾注培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数。6.4.3试验组：取供试液1ml，过滤，冲洗，分别在最后一次的冲洗液中加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、入白色念珠菌和黑曲霉试验菌悬液各1ml，过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿菌落计数法测定其细菌数6.4.4稀释剂对照组：用相应的稀释液即PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供使品，加入各试验菌1ml，按实验组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。6.4.5阴性对照组：取实验用的稀释液1ml，制备滤膜，滤膜菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基至少制备一张滤膜，均不得有菌生长。备注：以上各菌悬液中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基作为细菌计数；白色念珠菌和黑曲霉玫瑰红钠琼脂培养作为霉菌酵母菌计数。6.5培养和计数以上各组中做细菌计数的平皿与30-35℃倒置培养3天，霉菌、酵母菌与23-28℃倒置培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分