药品微生物限度方法学验证一、目的：建立外用药类微生物限度检查，细菌、霉菌及酵母菌的计数方法及控制菌：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检验方法。二、范围：适用于我公司外用药类微生物限度检查三、引用标准：中华人民共和国药典（2005年版）二部附录四、内容：4.1、仪器及设备：干燥箱、生化培养箱、超净工作台、培养皿。4.2、试剂：0.9％无菌氯化钠溶液、PH7.8无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MVG培养基、靛试剂等4.3、验证所用菌种：大肠埃希菌CMCC(B)44102黄金色葡萄球菌CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F)98001黑曲霉CMCC(F)98003铜绿假单胞菌CMCC(B)10104此上菌种均为中国生物制品检定所购买，且传代次数未超过五代4.4、验证所用样品：林旦乳膏批号：050801规格：1％（30g）五、试验过程5.1菌液制备：分别取经35°的制培养24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1ml，加至9ml生理盐水中，逐管10倍量稀释制成每1ml含菌量在50-100cfu。取经25°培养24小时白色念珠菌的改良马丁培养物1ml，逐管10倍量稀释制成每1ml含菌量在50-100cfu。取经25°培养1周的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml洗脱孢子，取1ml孢子液用0.9%无菌氯化钠溶液，逐管10倍量稀释至每1ml含孢子数为50-100cfu的孢子悬液。5.2．供试品溶液的制备：称取林旦乳膏10g，加PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100ml，混匀。5.3．回收率测定5.3.1．细菌数测定（1）、试验组：培养基稀释法取供试液0.1ml及每1ml中含5－100CFU的枯草芽孢杆菌菌悬液1ml，分别注入营养琼脂培养基，平行制备10个平皿，培养，计数。（2）、菌液组：测定所加的试验菌数。（3）、供试品对照组：测定样品的本底菌数。（4）回收率计算试验组菌回收率=试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数×100%菌液组平均菌落数（5）、结果判定：菌种名称批号试验组供试品对照组菌液组回收率结果判定枯草芽孢杆菌05080167，68，740，0，092，91，9575.3符合规定结论：按照«微生物限度检查操作规程»制备，林旦乳膏供试品液方法和细菌计数法测定菌回收率三次独立平行试验中，试验细菌回收率均为70％以上，结果符合中国药典2005版微生物限度检验中外用药类计数方法验证要求。5.3.2、霉菌及酵母菌计数法（1）、试验组：培养基稀释法称取林旦乳膏10g，加PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100ml、取供试液0.1ml及每1ml中含50－100CFU的黑曲霉菌菌悬液1ml，分别注入玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备10个平皿，培养，并测定其菌落数。（2）、菌液组：测定所加的试验菌数（3）供试品对照组：测定样品的本底菌数（4）、结果判定：菌种名称批号试验组供试品对照组菌液组回收率结果判定白色念珠菌黑曲霉菌05080170，74，710，0，094，97，8976.3符合规定结论：按照«微生物限度检查操作规程»，制备林旦乳膏供试品液方法和霉菌及酵母菌计数法测定回收率三次独立平行试验中试验菌回收率均为70％以上，结果符合中国药典2005版微生物外用药类霉菌及酵母菌计数方法验证要求5.3、控制菌-金黄色葡萄球菌（1）、试验组：取林旦乳膏10g，加0.1％无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液90ml，为供试品溶液。取10ml供试品溶液及每1ml中含10－100CFU的金黄色葡萄球菌悬液1ml，加入营养肉汤培养基中，按照«微生物限度检查操作规程»黄金色葡萄球菌检验方法进行检验。（2）阴性菌对照组：取上述供试品溶液10ml及每1ml中含10－100CFU的大肠埃希菌菌悬液1ml，加入营养肉汤培养基中，按照«微生物限度检查操作规程»金黄色葡萄球菌检验方法进行检验。（3）、验证结果表：金葡菌+供试液大肠埃希菌+供试液供试液金葡菌阴性菌对照组检出未检出未检出检出未检出检出未检出未检出检出未检出检出未检出未检出检出未检出结论：按照«微生物限度检验操作规程»，制备林旦乳膏供试品溶液，按控制菌－金黄色葡萄球菌检验方法进行检验，阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组按控制菌－金黄色葡萄球菌检验方法进行检验，均检出试验菌，试验结果表明，按照«微生物限度检查操作规程»制备林旦乳膏供试品液方法和控制菌－金黄色葡萄球菌检验方法符合中国药典2005版外用药微生物限度检查对控制菌－黄金色葡萄球菌检验方法的验证要求。5.4、控制菌－铜