HPLC色谱条件的优化与色谱技术进展一、分离度方程式混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内容属于色谱热力学的范畴。容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因子α决定了组分的分离选择性。这二个重要的色谱参数都取决于溶质、固定相和流动相的热力学性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下，只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这种差异又足够大时，就有可能实现分离。要使分离的可能性变为可行，则必须设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素的关系是色谱动力学的内容。1、Rs分离度a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2）b）Rs＜0.8不符合分析化学要求Rs=1二峰重叠2%Rs＞1.2二峰完全分离2、K容量因子a）K=（tR-tO）/tob）K对分离度的影响Rsαk/（K+1）常用溶剂的溶解度参数δ（25℃）对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解度参数（δ）基本呈平行关系。混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平均值。溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量因子10倍的变化。3、N理论塔板数a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2b）N对分离度的影响RsαNc）提高柱效的方法●增加柱长●改进柱填料（纯度、物理性状）●提高填装质量4、α分离因子a）α=K2/K1=t＇R2/t＇R1b）α对分离度的影响Rsα（α-1）/α影响敏感，α的微小变化可显著改变Rsc）改变α的方法在保持流动相极性基本不变的前提下，适当改变流动相的组成、组分的比例或添加调节剂。5、N与α对Rs贡献的比较二、VanDeemtor方程1、柱效与流速的关系存在最佳流速2、柱效与填料粒径的关系a）A=2λ·dp式中2λ为与填充均匀性有关的因数dp为填料的粒径b）小的dp有利于传质c）减小填料粒径可显著提高柱效由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短恒压色谱柱→增加流速↓↓缩短洗脱时间三、影响分离效果的其他因素●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料（＜3um）或长色谱柱→提高柱效●提高灵敏度色谱峰高与柱温呈指数函数关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈指数增加，数据表明，柱温从30℃上升至90℃，定量限约可降低10倍。●改善选择性不同溶质的保留时间随柱温变化的程度不尽相同，有可能使原来未分离的成分的得到基线分离，甚至发生洗脱顺序逆转。这种温度使选择性改变的特性在混合物的分离中非常有用，因为它只需简单地改变柱温，而无需改变其他色谱条件。●温度匹配流动相须预热至柱温，温度匹配可以使柱效提高50%以上。柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速降到一固定值（如35℃），以避免检测信号的波动。●色谱柱以硅胶为基质的填料，其使用温度一般不超过60℃；HTLC使用以氧化锆、多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采用多配位基有机硅胶为填料。2、pH引入次级化学平衡（电离、络合、离子对等）改变溶质的浓度或存在形式，用以提高选择性。3、柱外效应UPLC的技术要求V池＜0.1V柱（2—5ul）V管路＜0.1V柱（0.1mm,id）V进样＜0.15V峰（2—5ul）tC＜0.1tR（10—15S，自动进样器）V死＜0.3ml死体积的影响●延迟出峰时间●减低柱效●使梯度曲线变形四、UPLC（UFLC）的评估2、短处：●高柱压降（泵，摩擦生热导致柱效下降和选择性变化）●色谱成分残留●进样器交叉污染●供试液需径0.2u滤膜过滤●可选色谱柱有限●不太适合生物学基质样品●不适用于常规质量控制●尚未通过GLP认证3、综合评估a）结合效率和成本考虑，在不少情况下2u的填料未必比3u的填料有太多的优势b）采用亚-2um填料时应考虑：●使用现有设备的能力●利用选择性的可能性c）展望不是现在，也许是不远的将来谢谢！