PCR引物设计原理PCR反应一般由三个步骤组成:①模板得热变性;②引物复性到单链模板上;③热稳定DNA聚合酶催化得延伸变性复性温度(退火温度)至关重要！！！退火温度太高,引物不能与模板很好地复性,扩增效率会非常低;退火温度太低,引物将产生非特异性复性,从而导致非特异性DNA片段得扩增;退火温度,通常比理论设计得引物与模板得Tm值低3-5℃下进行。最好通过对复性温度比两条引物得Tm值低2-10℃内进行PCR预实验(梯度)来对复性条件得优化。对TaqDNA聚合酶来说,最适温度为72-78℃,时间约为1min。引物设计要点(3)重复或自身互补序列:形成发夹结构,会阻止引物与模板之间得复性。(4)上下引物得互补性:一个引物得3'末端序列不允许结合到另一个引物得任何位点上,因为PCR中引物浓度较高,会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时,注意检查任何一个3'末端都不能与其她任何引物互补。(5)解链温度(Tm值):计算出来得两个引物得Tm值相差不能大于5℃,扩增产物得Tm值与引物得Tm值相差不能大于10℃;引物得Tm值一般为50-70℃。这些特性保证了扩增产物在每一个PCR循环可有效变性。(6)3’末端3’末端得性质非常关键。如果可能得话,每个引物得3’末端碱基为G或C;最好不要A,或AA等多聚A;但不推荐3’末端有…、NNNCG或…、、NNNGC序列得引物,GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。大家学习辛苦了，还是要坚持当末端碱基为A时,错配时引发链合成得效率大大降低;当末端碱基为T时,错配情况下亦能引发链得合成,所以一般PCR反应中,引物3’末端得碱基最好选T、C、G,而不选A。引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大得差异,当末位得碱基为A时,即使在错配得情况下,也能有引发链得合成,而当末位链为T时,错配得引发效率大大降低,G、C错配得引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。？？(7)5’端序列添加限制性酶切位点:一些概念正向引物(forwardprimer):处于DNA双链上游得引物。如用于测序,则从5’→3’方向读出DNA正链得序列。反向引物(Reverseprimer):处于目得DNA双链下游得引物。如用于测序,则读出DNA负链从下游到上游得反向序列。PrimerPremier5、0软件设计引物正向(Asis)、反向(reversed)、互补(plemented)及反向互补(reverseplemented)。正向(Asis)反向(reversed)互补(plemented)Enzyme软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map,分别以序列或图示得方式显示结果。缺点:不能以文本得形式保存结果。MotifPrimer点击Search,进行引物搜索Searchcriteria窗口:多种参数可以调整。Manual→Searchparameters→人工搜索参数设置窗口。Searchprogress窗口中显示Searchpleted→OK键结果窗口→有三种显示形式,上游引物、下游引物与成对显示。引物按优劣次序排列,满分为100。选其中得一对引物,在主窗口显示结果。该图分为四部分:最上面就是图示模板及产物位置,“S”与“A”可查瞧有义链或反义链得引物。右边就是两个引物在模板上结合位置得直观图;第二层就是模板及引物序列得配对情况;第三层显示引物得各种参数。注意:尾末给出该引物得最佳退火温度！！第四层:四种重要指标得分析引物长度:控制着引物得特异性与在PCR反应中得退火温度。长得PCR引物能给扩增带来更好得特异性,可以通过降低退火温度提高反应得灵敏度,不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27nt。BLAST验证引物在EnterQuerySequence栏中输入引物序列:例:引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’→3’。输入上游引物后,加上≥20个字母n,再输入下游引物。在ChooseSearchSet栏中:Database根据预操作基因得种属定了,可选Humangenomic+transcript或Others在ProgramSelection中:选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项,如下图:在GeneralParameters中:Expectthresshold期望阈值须改为1000,大于1000也可以;在Wordsize得下拉框将数字改为7。图中:序列与引物匹配得得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等,分值越高,特异性越好;线段代表上或下游引物,其颜色与上面