PCR引物设计原理PCR反应一般由三个步骤组成：①模板的热变性；②引物复性到单链模板上；③热稳定DNA聚合酶催化的延伸变性复性温度（退火温度）至关重要！！！退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低3-5℃下进行。最好通过对复性温度比两条引物的Tm值低2-10℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。对TaqDNA聚合酶来说，最适温度为72-78℃，时间约为1min。引物设计要点（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。（4）上下引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。（5）解链温度（Tm值）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般为50-70℃。这些特性保证了扩增产物在每一个PCR循环可有效变性。（6）3’末端3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般PCR反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位点：一些概念正向引物（forwardprimer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5’→3’方向读出DNA正链的序列。反向引物（Reverseprimer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出DNA负链从下游到上游的反向序列。PrimerPremier5.0软件设计引物正向（Asis）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reversecomplemented）。正向（Asis）反向（reversed）互补（complemented）Enzyme软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。MotifPrimer点击Search，进行引物搜索Searchcriteria窗口：多种参数可以调整。Manual→Searchparameters→人工搜索参数设置窗口。Searchprogress窗口中显示SearchCompleted→OK键结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！！第四层：四种重要指标的分析引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27nt。BLAST验证引物在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’→3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物。在ChooseSearchSet栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Humangenomic+transcript或Others在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：在GeneralParameters中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就