变性与复性DNA的变性(denaturation)：解链温度（融解温度，Tm）(meltingtemperature)：增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。DNA的复性（renaturation)：减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。1.常用的变性方法：2.影响复性的因素PCR技术总论聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称TaqDNA聚合酶。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。PCR基本原理PCR原理PCRproductPCR反应曲线标准的PCR反应体系PCR反应五要素引物引物设计的原则（一）引物设计的原则（二）引物设计的原则（三）引物设计的原则（四）酶及其浓度dNTP的质量与浓度模板（靶基因，targetgene）模板（靶基因，targetgene）Mg2+浓度PCR反应条件的选择温度与时间的设置：①变性温度与时间：②退火(复性)温度与时间：引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：③延伸温度与时间：③延伸温度与时间：循环次数PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低热启动PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCR连接酶链反应RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异PCR1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究2)反向PCR(reversePCR)已知序列3）多重PCR（复合PCR）电泳4）LP-PCR（Labelledprimers)标记引物5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）cDNA6）PCR固相分析法7）原位ＰＣＲ操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物8）ＲＴ－ＰＣＲ9)荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。5’实时荧光定量PCR仪什么是测序？Sanger第一步：加入复制终止剂Sanger第二步：荧光检测Shotgun测序DNA整体Shotgun测序（2）——拼接错误：Repeat的存在基因的概念经典遗传学中基因的概念孟德尔称控制性状的因子为遗传因子1909年约翰生提出了基因这个名词，取代孟德尔的遗传因子→摩尔根等人对果蝇、玉米等的大量遗传研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学经典遗传学认为：基因是遗传上最小的结构与功能单位，不能分割。是结构与功能的统一体分子遗传学中基因的概念基因的本质：（1）基因是特定长度和碱基序列的DNA片段（2）核苷酸序列中蕴藏着遗传信息：mRNA多肽DNAtRNArRNA调节基因基因的功能类型基因的几种特殊形式(3)断裂基因或隔裂基因(4)跳跃基因(jumpinggene)