一样品制备1.细胞培养和蛋白提取(1).MEM培养基的准备(配制400mL)①制备氨基酸储液：分别在20mLL-Arginine缺陷型MEM培养基中配置(50%正常浓度)的13C6L-Argininehydrochloride和13C6,15N4L-Argininehydrochloride储存液(均称取26mg)，待充分溶解后，分别用μm的无菌滤器过滤。②分别加入20mL除菌后的氨基酸储液、10%的透析胎牛血清、1%的青链霉素、2mM的L-Glutamine和2mM的丙酮酸钠并用缺陷型MEM培养基定容到400mL，贮存于4°C。每种完全培养基中的氨基酸浓度见表4-1：表4-1MEM培养基中轻、中、重L-Arginine的浓度CelllinesAminoAcidsM.W.CultureMediaAmount(concentration)AL-ArginineRPMI1640241.9mg/L()B13C6L-ArginineMEM65.0mg/L()C13C6,15N4L-ArginineMEMmg/L()(2).细胞培养将A、B、C三种细胞复苏后，分别接种于10cm培养皿中，在常规RPMI1640培养基(添加10%的透析胎牛血清和1%的青链霉素)中培养HL-7702，分别使用仅含有13C6L-Argininehydrochloride和13C6,15N4L-Argininehydrochloride的MEM培养基培养B和C，经过5-6个细胞世代的培养后，将细胞数量扩增到107-108左右(5-6盘)。(3).蛋白提取用500μl全细胞裂解液(50mMTris，pH7.4；150mMNaCl；1%Triton-100；1mMAEBSF；20μl/μgaprotinin；20μl/μgleupeptin)2.蛋白质含量测定(1).采用改进的Bradford法，将BSA分别稀释为从范围内若干浓度，待测样品稀释10倍、20倍，各取20μL加80μLHCl，轻轻混匀。(2).各管再加入过滤的稀释4倍的dyereagent，轻轻混匀，静置5min后测A595值。(3).取A595值对BSA标准浓度作标准曲线，再根据待测样品的A595值，从BSA标准曲线中确定其浓度。(4).同位素标记样品与非标记样品按照蛋白含量1:1混合。3.SDS-PAGE分离和染色(1).电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶;(2).2×SDS上样缓冲液的配制：2mLTris-HCLbuffer(,pH6.8)；2mL甘油；1mL巯基乙醇；4mL10%SDS溶液；适量水补足体积至10mL，混匀即得。(3).电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶，先恒流10mA，运行时间，再于20mA运行至溴酚蓝前沿到达分离胶底部。(4).胶体考马斯亮蓝染色方法如下：用10%甲醇，7%乙酸溶液固定30min，然后用胶体考马斯亮蓝溶液(0.12%G-250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇)染色过夜，用蒸馏水或10%甲醇水溶液脱色，清洗胶数遍即可获得背景清晰的染色效果。4.胶内酶解、肽段提取(1).用干净的解剖刀将胶按照从高分子量到低分子量全覆盖切成3-4mm宽度的胶条，大约切成20个条带左右。然后将每个胶条切成1-2mm2大小的胶块。(2).100μL50%乙腈/25mmol/L碳酸氢氨浸泡胶粒，超声10min，弃去溶液，重复1-2次至胶粒的蓝色褪尽。(3).真空离心干燥至胶粒完全脱水，加入10-15μl10ng/μL的胰蛋白酶(25mmol/L碳酸氢铵溶解），4°C冰箱放置30-40min，吸走多余酶液或补充25mM碳酸氢铵覆盖胶粒，37°C保温18-20小时。(4).80-100μl5%TFA40°C提取1h，期间超声两次，取出上清。80-100μl2.5%TFA/50%ACN30°C提取1h，期间超声两次，合并上清，离心干燥。二质谱分析与数据库检索1.LC-LTQ-FT分析1).毛细管色谱系统在Agillent1100系统上进行，由自动上样器上样，上样体积为30μl，上样流速为10μl/min；色谱洗脱在由二元泵系统上进行，洗脱下来的组份经过ESI离子源直接进入质谱，液相色谱条件为：流动相A：0.1%FA-98%水溶液；流动相B：0.1%FA-80%ACN溶液。洗脱条件：0-90min，流动相比例由2%B线性升至40%B；90-105min，流动相比例由40%B线性升至100%B；维持15min后，以100%流动相A平衡色谱柱30min。流动相流速为300nL/min。2).质谱仪为线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-FT，ThermoFinnigan)，磁场强度为7特斯拉。雾化N2气流速(sheathgas)1