会计学实验(shíyàn)八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(shíyàn)操作及注意事项实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清(rènqīnɡ)试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm）封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min）注意事项：1、封管要严，防止漏液。2、固定玻璃管要竖直(shùzhí)，防止夹碎。3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗）5、正丁醇沿管壁缓缓加入/加buffer样品处理(chǔlǐ)并加样（20ul）电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时停止）剥胶二、电泳基本原理及相关(xiāngguān)知识电泳(diànyǒnꞬ)的概念电泳(diànyǒnꞬ)的基本原理电泳分离蛋白质的原理(yuánlǐ)电泳的影响(yǐngxiǎng)因素实验室中常用(chánꞬyònꞬ)到的电泳方法（以介质分类）原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳(diànyǒnꞬ)称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(diànyǒnꞬ)(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节(tiáojié)，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节(tiáojié)凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离(fēnlí)物质分子量密切相关。分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415–20104–1055-10105-2×1062-2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳(diànyǒnɡ)分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(diànyǒnɡ)(如图1)和板状电泳(diànyǒnɡ)(如图2)，两者电泳(diànyǒnɡ)原理完全相同。////蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而(yīnér)掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而(yīnér)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分离(fēnlí)蛋白质的原理不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种p