浅谈“基因敲除”吕飞（浙江省嵊州市第一中学312400）电话：0575-83398036手机：13557550570E-mail:4883012@qq.com摘要：鉴于近年来基因敲除平凡的出现在高中生物教材和试题中，又基于基因敲除与基因工程的联系以及基因敲除的广泛的应用价值，本文对基因敲除作了简单的探讨。关键词：基因敲除高考应用科学界曾预言，21世纪是一个基因工程世纪。所谓基因工程（转基因技术），又称基因拼接技术和HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/97035.htm"\t"_blank"DNA重组技术，诞生于20世纪70年代，在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。“基因敲除”是在20世纪80年代悄然诞生并发展起来的一项重要的分子生物学技术，字面上看看与转基因相反，认为转基因技术是导入某个基因，而基因敲除是切除某个基因，实质上并不是如此简单，很大程度上，基因敲除和转基因技术有相似性，转基因技术的原理是基因重组，而基因敲除主要也是应用DNA同源重组原理。一、“基因敲除”在高中生物教材中的出现浙科版教材，选修3《现代生物科技专题》一书的P52页，第二段第二行，出现了“基因敲除”四个字，书本原话：“胚胎干细胞可以进行基因敲除，获得基因敲除动物，如用基因敲除手段可以获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。”二、基因敲除的概述及方法1、概述基因敲除是自80年代末以来发展起来，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/15047.htm"\t"_blank"干细胞技术基础上的一种定点修饰基因组的新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，其与体细胞核移植技术的成功结合，已经成为一种有效的定点修饰、改造大动物基因组DNA片段的实验策略。或者说基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。举一个简单的例子:比如有一段"序列":"1234567890"(原基因),敲除后为:"1237890",一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因,如"ABC",则新的基因为:"123ABC7890"；或者不插入基因直接连接，则为“1237890”。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。在基因敲除技术中涉及到的变异类型有：基因重组、基因突变、人工诱变。2．实现基因敲除的多种原理和方法2.1利用基因同源重组进行基因敲除。此方法依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。第一步是构建基因载体，第二步是获得ES细胞（同源的胚胎干细胞），第三步是同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入ES细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。2.2利用随机插入突变进行基因敲除。此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。2.3.RNAi引起的基因敲除。由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。三、“基因敲除”在09年高考中的出现3.1、（2009年重庆高考卷理综试题31.（16分））小鼠基因敲除技术获得2007年诺贝尔奖，该技术采用基因工程、细胞工程、杂交等手段使小鼠体内的某一基因失去功能，以研究基因在生物个体发育和病理过程中的作用。例如现有基因型为BB的小鼠，要敲除基因B