免疫组化技术的原理利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特异性抗原和抗体进行定位、定性或定量检测的一门技术。免疫组化的发展史1941年，Coons免疫荧光技术1968年，Nakane(中根一惠)酶标记技术1974年，SternbergerPAP技术1975年，Kohler和Milstein单克隆抗体技术1981年，Hsu(许世明)ABC法1990年代--现在，SP法，原位杂交，原位PCR免疫荧光组织(细胞)化学免疫荧光组织(细胞)化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量免疫荧光技术的不足需要荧光显微镜荧光衰减,不能长期保存定位不准确免疫组化的优点特异性强敏感性高定位准确、形态与功能相结合免疫组化主要染色方法的原理主要的技术:免疫荧光技术免疫金银标记技术免疫酶标记技术(PAP法)亲和免疫组化技术(ABC法,SP法)一、直接法抗原＋酶标Ⅰ抗（特异性抗体）＋底物用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位③较易获得的酶分子，最好有商品出售④中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变，⑤酶标过程中，酶与体连结，不能影响二者的活性⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占16%～18（8条糖链分布在HRP分子表面），分子量40kD，最适pH5～5.5，最适温度40～45℃；pH4～11，50℃以下均较稳定，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。免疫细胞化学常用的酶显色反应(底物)HRP的底物DAB(3，3-二氨联苯胺)棕黄色4-氯-1-萘酚灰兰色α-笨脂派若宁红色ALP是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色GOD是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（PhenazineMethylsulfate）0.167mg,0.05mol/LPB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀直接法的优点:方法简单,特异性高。直接法的缺点:每一种特异性抗体都需要标记,敏感性相对较低.二、间接法抗原＋Ⅰ抗（特异性抗体）＋酶标Ⅱ抗＋底物间接法的优点:不必标记每一种抗体敏感性提高3-4倍三、酶桥法基本原理首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。抗原＋Ⅰ抗＋Ⅱ抗＋Ⅲ抗（酶抗）＋酶＋底物注意：Ⅰ抗与Ⅲ抗同源酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示.为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。四、PAP法(peroxidaseanti-peroxidase)抗原＋Ⅰ抗＋Ⅱ抗＋PAP复合物＋底物PAP复合物：(2分子抗体3分子酶),小而稳定,穿透性好注意：Ⅰ抗与PAP复合物同源,第二抗体必须过量优点:敏感(较间接法敏感100倍),非特异性染色极轻微五.ABC法A-(avidin)卵白素,B-