改善反相HPLC中的峰拖尾在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏度减弱，精密度和定量变差。图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。图1拖尾对分离度和灵敏度的影响当峰拖尾（T，拖尾因子）从1.0增加到2.0时，分离度（Rs）从1.5降到1.0。灵敏度（峰高）由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。图2峰拖尾对准确度和精密度的不利影响。拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点，故而影响准确度和精密度。在这个例子中，在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：1、溶解样品的溶剂比流动像更强，2、样品量过载，3、固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应，4、硅胶吸附酸性化合物，5、色谱柱柱床中有空隙。只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。（表1）表1峰拖尾：原因及解决方案原因解决方案样品溶剂极性强于流动相在流动相中溶解样品，尽可能降低样品溶剂的强度样品量过载减少进样量，参考表2中推荐的不同柱型对应的不同进样体积硅醇基与胺类物质的结合1.调节流动相的pH<3.0。2.增加流动相的离子强度，25mM～50mM。3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM的TEA（三乙胺）。4.选择低硅醇活性的固定相。参照图6C18柱按固定相硅醇活性分级。5.酸性物质在硅胶上的吸附1.增加流动相中盐的浓度，25mM～50mM。2.调节流动相的pH<3.03.增加竞争性的有机酸，1%醋酸或者是0.1%TFA（三氟乙酸）柱子空隙更换新的色谱柱尝试填充空隙很少能达到较好的效果。一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾如果溶解样品的溶剂极性强于流动相，就会引起宽的甚至是拖尾的峰。有几种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾。第一种就是先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；另一种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后进样峰拖尾减轻了。如果怀疑拖尾的原因是流动相的强度引起的，解决很简单。将样品溶解在流动相中，或者将样品经流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求。二、由样品量过载引起的峰拖尾当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现一个直角三角形。当更多的样品量注入时，峰的前端变得很尖而后端就拖尾更严重。另一个现象就是色谱柱过载后保留时间会随样品量的增加而提前。（见图3）由样品过载引起的峰拖尾的解决方案就是减少进样量。表2提供了各色谱柱的直径及参考的最大进样量，表2还提供了进样量的范围，因为实际进样量依赖于柱子的填料（具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量），分析物质（分子量大的进样量要少），和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。图3样品量过载引起的拖尾样品过载，峰的前端会变得尖锐，后端拖尾，保留时间会稍微提前。如果峰形看上去有点像直角三角形，那么可能就是过载了。表2HPLC色谱柱的参考最大进样量柱直径（mm）ID参考最大样品量（mg）1035-654.64.5-9.03.02.0-4.0表3反相HPLC常用缓冲液缓冲液pKa缓冲液范围UV截止波长（nm）磷酸盐2.11.1～3.12007.26.2～8.212.311.3～13.3醋酸盐4.83.8～5.8210柠檬酸盐3.12.1～4.12304.73.7～5.75.44.4～6.4Tris（三羟甲基氨基甲烷）8.37.3～9.3205三乙胺11.010.0～12.0200三、由固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾在反相HPLC中出现拖尾的另一个常见的原因是由于带正电荷的溶液（胺类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换而引起的二次保留(图4)，具有显著的硅醇活性的固定相的色谱柱大部分都会发生此现象，而且中性pH（6～8）条件下比在酸性pH（<3）更易发生。酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应的影响。如果是因为硅醇的原因引起的拖尾，可以从下面几部来纠正拖尾的问题。首先，确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件下操作。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。在pH<3的条件下操作，可使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少了溶质与硅醇反应的几率。图4相互作用引起的峰拖尾固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点，经反相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。另一种解决拖尾的方法是在流动相中加入竞争性的胺类，加到流动相中的三乙胺（TEA）就是这个目的。TEA可以与硅醇发生强的反应，并抑制样品中的胺类与硅醇反应。图5是TE