会计学实验目录实验一实验计划表基因工程（GeneEngineering）又称ＤＮＡ重组技术，把不同生物的ＤＮＡ与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套琼脂糖、1×TBE、加样缓冲液⑴目的基因的获取基因组总ＤＮＡ提取凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增目的基因ＰＣＲ产物的电泳检测ＰＣＲ产物纯化获得目的基因ＭＨＣ⑵ＤＮＡ重组、转化ＭＨＣ与pMD18-T连接DH5a感受态细胞制备转化、平板涂布、培养⑶筛选与鉴定抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质粒酶切、电泳检测2.微量移液器的使用⑵使用注意事项3.琼脂糖凝胶制作掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。消化缓冲液:TE、EDTA、NaCl、SDS、蛋白酶KTris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇１、切取组织，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55℃水浴过夜，获得组织消化液。２、取出消化组织液，5000rpm，３min，取上清液于新离心管。３、加等体积Ｔris-平衡酚，轻轻混匀５min。4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管。５、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀５min。６、同４。７、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀５min。８、同４。９、加1/10体积3mol/LNaAc，及２.５倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。－２０℃沉淀３０min。１０、12000rpm，15min，弃上清。１１、加70%乙醇1ml，混匀。１２、同１０。１３、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。１４、加３０ulTE或ddH2O溶解ＤＮＡ。１５、琼脂糖凝胶电泳检测。提取染色体ＤＮＡ的基本原理是什么？操作中应该注意什么？１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。１、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。２、ＰＣＲ反应体系引物、dNTP、Mg２＋、模板、TaqDNA聚合酶，Buffer。３、ＰＣＲ循环参数①9５℃5min②9５℃30s③5２℃30s④72℃30s⑤goto②２９times⑥72℃10minTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液１、在0.2mlPCR微量离心管中配制30ul反应体系。ddwater10×PCRbuffer（不含MgCl2）3ul25mMMgCl22ul10mmol/LdNTP1ul10μmol/LPrimer11ul10μmol/Lprimer21ul模板1ulTaq酶l总体积30ul２、在离心机中混匀。３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。４、PCR结束后，取3ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。五、思考题实验四凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接一、实验目的二、实验原理2.利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。3.Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。三、实验用具及试剂1.2%琼脂糖凝胶电泳2.在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3.加入5个凝胶体积量的DR-ⅠBuffer4.混匀65℃加热融化凝胶块5.加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积的DR-ⅡBuffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇6.将上述溶液short后转移至spincoloumn中12000rpm,1min弃滤液7.加入500ulRinseA12000rpm30s弃滤液8.加入700ulRinseB12000rpm30s弃滤液9.同810.将spinco