第十二章酵母基因工程1974Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母中存在质粒。1978Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标志着酵母表达系统建立1981Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。1983我国首次用酵母菌表达HBVHBsAg基因。1996完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测序一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征二、酵母菌表达外源基因的优势：不足之处产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等幻灯片7解决内部降解的方法在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物；将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性；利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。幻灯片5第二节常用酵母表达系统酿酒酵母中的2环状质粒：表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝数高。整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。二、甲醇营养型酵母表达系统表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物不宜于食品等蛋白生产巴斯德毕赤酵母生产医药用重组蛋白质毕赤酵母表达系统的特点含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。发酵工艺成熟，易放大。培养成本低，产物易分离。外源蛋白基因遗传稳定。作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。三、裂殖酵母(Schizogenesispombe)表达系统外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。研究较少。四、酵母菌的转化方法原生质体转化法原生质体转化法的缺点：2）碱金属离子介导转化法3）电击转化法五、用于转化子筛选的标记基因宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变如：LEU-、TRP-、HIS-、URA-编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白六、利用酵母菌表达外源基因的步骤克隆重组→→酶切线性→→转化→→筛选转化子→→小规模诱导鉴定表达量→→大规模培养以及制备七、酵母表面展示系统即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定）使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。幻灯片26ＧＰＩ锚定区域与细胞蛋白的Ｃ-端共价相连，为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。ＧＰＩ锚定蛋白的Ｃ-端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成，前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上，其余蛋白则位于内质网的内腔中。在极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶作用下ω位点裂开并同时被ＧＰＩ锚置换，然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被切除，细胞蛋白被ＰＩ-ＰＬＣ从细胞膜上释放以ＧＰＩ锚定形式与葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外。幻灯片24凝集素展示表达系统酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、生物传感器、抗原／抗体库构建、免疫检测及亲和纯化、癌症诊断等领域。