目的要求（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。（2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。一、原理带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。离子交换过程示意：起始吸附解吸完成x+:起始缓冲离子y+：待分离离子z+：待分离离子二、离子交换剂的种类（二）按载体种类不同1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯+二乙烯苯聚苯乙烯（单体）（交联剂）二乙烯苯交联度=————————×100%苯乙烯+二乙烯苯交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性。目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20840m50297m100149m（代表二乙烯苯的百分含量）树脂resin（据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂强酸型含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂强碱含季胺基团[-N+(CH3)3]弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。2.离子交换纤维素阴离子交换纤维素—如:DEAE-纤维素pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素一般pH>4条件下使用,具有羧甲基3.离子交换凝胶—分离大分子物质如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）三、操作注意点考虑因素：1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量根据分离过程的实验条件强酸强碱—应用广泛弱酸型—只能在碱性pH范围内使用弱碱型—只能在酸性pH范围内使用（二）缓冲液的选择原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性(三)洗脱剂原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团改变pH或离子强度增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式：梯度洗脱四、应用离子交换层析法分离氨基酸及测定[原理]紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色[器材][试剂]实验步骤1．树脂的处理将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2．装柱取直径1cm,长度10－12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8~10cm的高度即可。装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。3．平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留3－4cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。4.加样揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1－2mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高3－4cm左右，接恒流泵。5.洗脱以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集60—80管。6．洗脱及氨基酸的鉴定向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。实验结果根据氨基酸的解离性质，分析该实验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来的顺序。Separationofaminoacidsonacationexchangecolumn注意事项在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。再见！