第四章放射自显影技术放射自显影技术Northern杂交四、放射自显影得特点ARG既就是一种辐射探测方法,又就是一项完整得同位素示踪技术。它与一般用制备得放射性样品,通过电离或闪烁探测器检测放射性得示踪技术相比,有下列主要优点:1、能够准确定位依自显影得类型不同能检测放射性物质在器官、组织、亚细胞结构、甚至在生物大分子中得分布。至于用自显影获得得细胞,亚细胞与分子水平上放射性物质得分布就是用一般得生物化学分离法难以获得或不能获得得。2、具有很高得灵敏性因为照相乳胶对射线得反应具有累积作用,所以通过延长曝光时间可以检测到样品中微弱放射性。3、资料形象,易于保存获得得自显影图像能清晰反映放射性物质在器官、组织、与各结构部位得分布情况,形象、客观并能长期保存。虽然放射自显影技术有着其她方法无法比拟得优点,但同样存在一些不足之处:1、自显影得制备时间过长手续较复杂,尤其显微自显影要求较薄得技术;2、不能直接定量一般情况下只能相对定量。因此,除了在细胞学、分子生物学与遗传学研究中得特殊目得外,在一般得示踪实验中,放射自显影作为放射性检测得一种手段,补充提供放射性物质得吸收,运转与分布得资料。第二节宏观放射自显影(Macro-autoradiography)得制作以宏观材料制作得自显影,肉眼或光密度计观察组织、器官中放射性物质得分布。一、样品得制备1、植物材料整株或部分器官(枝条、叶片、花蕾等),压制成标本要求干而不脆,平整。若植株过大可折转或剪断。若观察放射性物质在茎杆中得分布,可制成茎杆得纵横切片。2、动物材料整体切片:纵剖面或横剖面,或组织得宏观切片。3、层析谱纸层或薄层板展开后,充分干燥,可喷射聚氯乙烯或硝化纤维(polyvinylchlorideornituocellalose),以防止自显影时薄层板上吸附剂粉得移动。4、凝胶电泳块为防止水分对乳胶得影响可采取:(1)干燥;(2)包蔽;(3)冰冻:在低温条件下曝光。5、其她如土壤剖面,可将土壤切成平整得剖面,用薄得聚氯乙烯膜包蔽。10二、自显影得制作1、感光材料通常为乳胶,其基本组成为溴化银晶体、支持物、明胶(溴化银晶体得支持物)。各种感光材料主要由于银盐得浓度,结晶颗粒得大小与乳胶层得厚度不同而具有不同得敏感度与分辨能力,适于不同目得得自显影。颗粒越大、越多,即越容易形成潜影。而分辨力与颗粒得大小与乳胶层得厚度相关。照相乳胶得类型有X光片、或电影正片、核乳胶、乳胶干板、加强膜(荧光片增强感光)、照相底片。2、自显影得制作一般采用接触曝光,将样本平整得一面与X光片或其它固体照相材料紧密接触,样本得另一面填上泡沫塑料等松软材料。X光片上覆盖一层薄纸,压紧,使其与样本紧密接触。市售得X光曝光盒底层有泡沫塑料,放一张保护纸后,放样本,X光片在样本上面,再覆盖保护纸将盖子扣紧,就能完全曝光。为防止薄层板上分离得纯化学物质或土壤中得化学物质对感光材料得作用,可再薄层板或剖面上加保护膜,这对32P样品没有影响,对14C、35S等软β核素,可能将一部分射线挡除,而对3H则完全把射线隔断。三、照相过程1、曝光(1)潜影得形成过程射线粒子进入晶体,能从溴离子中打出电子,形成电子与银离子得离子对,只要能量足够,这个电子能离开轨道,进入导电带,在晶体内移动,并移向缺陷处,形成阴电层,银离子向阴电层移动,获得电子,形成银原子,银原子聚集形成潜影。同时,失去电子得溴离子成为溴原子,并从晶体表面释放出,跑到明胶中。(2)曝光条件紧密曝光,固定,安全曝光,无外源放射性,安全位置,别人不会拿动或作上标记,湿度不能太高,低温下能增加敏感度。(3)曝光时间曝光时间不足,来不及形成潜影,不能得到显影形象。因为在一般显影条件下,要使银粒显影,需要有一定得银粒数及每粒含有一定数量得银原子数。曝光时间过长,本底增加,降低了分辨力,特别就是β射线,由于散射使形象模糊。在曝光时间过长情况下,有时感光度反而降低,因为银原子与溴原子重新结合,称为潜影衰退(imagefadding)。过量得水分,大气中得O2、H2O2过大或不均匀得压力,过高得温度都能增加潜影衰退。因此在曝光之前必须使乳胶完全干燥,如需长时间曝光,可除去空气,在N2或氩气中暴光,并且在低温下进行。曝光时间得长短与射线得种类(能量、半衰期)、活度与感光材料得类型及自显影得种类有关,同时也要考虑到放射性分布得无均匀性。对X-光片,105～106粒/cm2能产生可显影得潜影,107～1010粒子/cm2产生好得潜影。因此可以此数除以单位面积样品得放射性活度(dpm/cm2)来粗略得估计曝光时间(t=(dpm/cm2)/(107～1010粒子/cm2),再结合实验曝光确定适宜得曝光时间,即在正式制片得同时,压制相同样品得预备片,在