课题一鹦鹉热嗜衣原体ＭＯＭＰ基因重组质粒的构建和免疫效果的初步研究ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｈｎｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓｔｕｄｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｏｆｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａＰｓｉｔｔａｃｉ研究生姓名王争强指导导师朱虹副研究员申请学位理学硕士专业名称军事预防医学起止日期２００３．９—２００６．７军事医学科学院微生物流行病研究所军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声呗所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得芏主堕堂銎鲎瞳或其它教弯规构的学位或迂书两使用过鲍材料。与我一圃王作魄同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字：杰耋兰筮签字日期：迦年，二￡月２望日军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解芏奎堕茎盟堂瞳有关保留、使用学位论文的规定。特授权墨奎垦堂銎芏睦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。（保密学位论文在解密后适月本授权书）论文作者签字：垂靠盗签字日期：巡年—￡月＿２望日指导教师签字：挫签字日期：２坐』年二￡月鲨日课题一鹦鹉热嗜衣原体ＭＯＭＰ基因重组质粒的构建和免疫效果的初步研究摘要鹦鹉热嗜衣原体（Ｃｈｌａｏｌｙｄｏｐｈｉ］ａｐｓｉｔｔａｃｉ，Ｃｐｓ）是一类专性细胞内寄生的人兽共患病病原体，能引起人和动物多种疾病。Ｃｐｓ对鸟类、家禽和家畜有很强的感染性。人类不是Ｃｐｓ的天然宿主，但宠物饲养者、养禽厂工人等与家禽家畜密切接触者可通过吸入具有感染性的分泌物而感染，引起肺炎和败血症。Ｃｐｓ主要外膜蛋白（ｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＯＭＰ）是呈感染性的原体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙｂｏｄｙ，ＥＢ）表面的主要膜蛋白，在原体的外膜蛋白中占６０％左右。氨基酸序列分析表明，ＭＯＭＰ的结构是五个保守区夹着四个可变区（ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎ，ＶＤ），血清型特异的抗原决定簇位于ＶＳＩ或ＶＳ２，而种或亚种特异的抗原决定簇位于ＶＳ４。本研究采用ＰＣＲ法获得了ＣｐｓＣＥ９株ＭＯＭＰ基因片断，并将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中，构建了重组表达质粒。通过聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）以及酶切方法对重组质粒进行了鉴定，结果表明外源基因已经成功地插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中。通过对重组质粒进行序列测定，结果表明目的基因已经成功地克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）上，且表达载体含有目的基因正确的开放读码框。测序结果与Ｃｐｓ其它菌株进行序列比对可知，该序列只有三个碱基突变，重组质粒上ＭＯＭＰ基因的氨基酸序列同标准序列的同源性为９９．６％。起始密码子ＡＴＧ后的第一个碱基为Ｇ，前面的碱基为ＡＡＣ，目的基因上已经含有外源基因转录必需的Ｋｏｚａｋ序列。利用磷酸钙法介导重组质粒转染ＣＯＳ一７细胞，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ方法鉴定外源蛋白在ＣＯＳ一７细胞中的表达情况，结果表明外源基因可以成功的在ＣＯＳ一７细胞中进行表达。用重组质粒对Ｂａｌｂ／ｅ小鼠进行免疫，采用间接ＥＬＩＳＡ法分析特异抗体的产生。经过３次免疫，小鼠产生了衣原体ＭＯＭＰ特异的抗体反应，血清抗体滴度随时间变化呈逐渐上升的趋势，并持续较长的时间。本研究为核酸疫蓖的深入研究提供了依据。关键词：鹦鹉热嗜衣原体，主要外膜蛋白，重组质粒，核酸疫苗，免疫原性课题一ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓｔｕｄｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｏｆｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａＰｓｉｔｔａｃｉＡｂｓｔｒａｃｔＣｈＪａｍｙｄｏｐｈｉ］ａｐｓｉｔｔａｃｉ（Ｃｐｓ）ｉｓａｎｏｂｌｉｇａｔｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｄｃａｎｉｎｆｅｃｔａｂｒｏａｄｒａｎｇｅｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｃａｕｓｅｖａｒｉｅｔｙｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｓ．Ｃｐｓｈａｓａｈｉｇｈｌｙｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｂｉｌｉｔｙｔｏｂｉｒｄｓ，ｐｏｕｌｔｒｙａｎｄｌｉｖｅｓｔｏｃｋ．ＨｕｍａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃａｎＯＣＣｔｆｆｗｈｅｎｅｖｅｒｔｈｅｒｅｉｓｃｌｏｓｅｍａｄｃｏｎｔｉｎｕｅｄｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈｔｈｅｉｒｉｆｅＣｔｅｄｂｉｒｄｓ．Ｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＯＭＰ）ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈ