第八章外源基因表达产物的分离纯化1、针对不同得产物表达形式采取不同得策略2、针对不同性质得重组蛋白选择不同得层析类型3、多种分离纯化技术得联合运用4、合适分离纯化介质得选择Sephadex就是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成得三维网状凝胶颗粒Superose就是在珠状琼脂糖颗粒得基础上经过两次交联后得到得5、分离纯化过程得规模化1、离子交换层析离子交换层析得基本原理离子交换介质得基本性质阴离子交换剂:强碱型与弱碱型大家有疑问的，可以询问和交流阳离子交换剂分为强酸型、中强酸型与弱酸型三类,强酸型含有－R－SO3H,中强酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2,弱酸型含有－COOH或－OH。阳离子交换进行得反应如下:阴离子交换剂分为强碱型、中强碱型与弱碱型三类,含有四级铵盐[－N+(CH3)3]为强碱型,三级以下铵盐[－N(CH3)2]、[－NHCH3]、[－NH2]都属弱碱型;同时具有强碱与弱碱型基团得,为中强碱型。阴离子交换树脂进行得反应如下:强离子交换剂得电离率基本不受pH值影响,离子交换作用得pH范围宽常用得离子交换剂离子交换纤维素:离子交换葡聚糖:常用得离子交换葡聚糖包括:离子交换琼脂糖:离子交换介质得选择原则离子交换层析得基本操作(2)样品进柱离子交换层析得基本操作1、平衡阶段:离子交换剂与反离子结合时刻要记住:蛋白质就是由氨基酸聚合形成得聚合物,所以蛋白质也存在等电点(pI),蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同,取决于所处溶液得pH值。当pI<pH时,蛋白质带净负电荷;而当pI>pH时,蛋白质带净正电荷。2、凝胶层析凝胶层析得基本原理凝胶过滤得作用机制带网孔得葡聚糖珠凝胶过滤层析过程示意图凝胶介质得基本性质琼脂糖凝胶就是由琼脂中分离出来得天然凝胶,常见得有Sepharose聚丙烯酰胺凝胶就是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联凝胶介质得选用原则将样品中一些分子量比较接近得物质分开,这种分离叫分级分离凝胶层析得基本操作上柱样品溶液得体积根据分离要求来确定:3、亲与层析亲与层析得基本概念抗原与抗体亲与得一对分子中得一方以共价键形式与不溶性载体相连亲与层析(affiuitychromatography)亲与层析原理示意图亲与层析载体得性质与选择纤维素纯化对象与配基之间必须有较强得亲与力酸酐法亲与层析得基本操作使用特异得配基作为洗脱剂亲与双方吸附能力很强,可以用专一得化学方法裂解配基与载4、膜分离膜分离得基本原理分离效率高分离膜得选择通透性:就是物质分离得第一机制根据分离膜膜内平均孔径、推动力与传递机制不同,膜分离可透析按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留得分子量。反渗透(ReverseosmosisRO)超滤(UitrfiltrationUF)超滤分离膜得基本性能微滤膜0、025-14mm对称性膜膜截面上得孔道结构均匀天然高分子膜醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素影响膜分离得因素三、基因重组蛋白包涵体得分离与复性包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体加工流程包涵体得洗涤包涵体得溶解蛋白质复性机理一般说来,在优化得条件下,大多数蛋白质体外复性效率在20%左右复性常用方法2、透析复性:好处就是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,速度慢,不适合大规模操作。3、超滤复性:选择合适载留分子量得膜,允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。缺点就是不适合样品量较少得情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆得变性(蛋白聚集于膜上)。4、色谱复性:兼具分离。4、1凝胶过滤复性:该法可以起到一定得抑制凝集作用,并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢,对有些蛋白质得复性有利。4、2吸附型层析复性:原理就是层析柱平衡后,将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上,然后用清洗缓冲液洗掉未吸附得变性剂与杂蛋白,最后用复性缓冲液将吸附得蛋白洗脱下来,在洗脱过程中完成复性。大肠杆菌得融合蛋白得分离纯化大肠杆菌表达得分泌型蛋白得分离纯化大肠杆菌细胞内可溶性表达产物得分离纯化大肠杆菌得周质表达蛋白得分离纯化四、重组蛋白质得鉴定1蛋白质含量得测定2、纯度鉴定色谱纯3、蛋白质鉴定3、1蛋白质分子质量及等电点得测定