非无菌药品生产企业洁净车间环境微生物鉴定及分析应用发布时间：2022-12-22T10:18:13.369Z来源：《中国医学人文》2022年25期作者：邱莎，曾博[导读]为了健全制药企业的环境微生物控制方案，为企业的风险评估提供借鉴和指导，本研究通过16SrRNA测序方式鉴定某制药企业洁净车间环境微生物，建立了环境微生物信息数据库，为企业偏差调查以及污染溯源分析提供非常有价值的信息，从而对企业有效的洁净环境及表面消毒与清洁方案提供更有力的技术支撑。邱莎，曾博（德阳市食品药品安全检验检测中心，四川德阳，618000）摘要：为了健全制药企业的环境微生物控制方案，为企业的风险评估提供借鉴和指导，本研究通过16SrRNA测序方式鉴定某制药企业洁净车间环境微生物，建立了环境微生物信息数据库，为企业偏差调查以及污染溯源分析提供非常有价值的信息，从而对企业有效的洁净环境及表面消毒与清洁方案提供更有力的技术支撑。通过调查洁净车间的环境微生物分布情况，发现污染源主要来源于人、设备、水，应采取有效的措施控制这些污染源，即能更好的保证药品质量。关键词：16SrRNA；环境微生物信息数据库；溯源分析微生物污染是影响药品质量和引发临床药品危害的重要原因之一[7]，根据相关报道[6]，2004-2011年间，因微生物污染被美国FDA召回的事件共642起，且逐年呈增加趋势，这些召回事件中涉及到的产品类型药品占比26%，因此预防和避免微生物对药品生产车间的污染是保证药品质量安全的重要手段。通过对洁净室空气、表面和人员中的细菌进行长期监测，揭示药品生产企业洁净区微生物群落的分布特征，分析洁净区微生物群落的构成及筛选出优势菌株，用于研究更有效的消毒方法，为质量管理人员提供可靠的数据参考。本研究通过收集一家非无菌药品生产企业洁净车间环境微生物，并进行鉴定，建立了覆盖整个药品生产过程的生产环境微生物数据库，为该车间后续微生物污染溯源分析提供了数据基础，对企业环境控制和风险评估有重要的意义。1仪器与试药微生物培养箱BXP-280S（上海博讯），实时荧光定量PCR检测系统CFXConnect（美国BIORAD公司），水平电泳仪及凝胶成像分析系统(德国耶拿)胰酪大豆胨琼脂培养基购于广东环凯微生物科技有限公司，PremixTaq(TaKaRaTaqVersion2.0plus购于dye)TaKaRa。细菌采用16SrRNA通用扩增引物27F和1492R，以上引物均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，引物序列见表1。表1引物序列表2方法2.1菌种的收集与企业共同商定生产及储存环境的监控方案，其中监测环境包括称量室、充填室、混合室、内包室、洁净工艺走廊内包材暂存室及内包材暂存室等相关环境。通过使用胰酪大豆胨琼脂培养基收集环境中的沉降菌株，并将其分离培养纯化后进行鉴定。同时对分离纯化出的菌株35%甘油保存，作为环境微生物监测库。2.2菌种的鉴定在本研究中，菌株主要通过对微生物的16SrRNA测序并比对的方式进行鉴定。首先，挑取已经分离纯化后的菌株到10μlddH2O中，然后通过100℃裂解10分钟，取上清作为PCR模板，取PCR模板2μ，lPremixTaq25μ，l上游引物1μ，l下游引物1μ，lddH2O21μl，然后以下列程序进行PCR，94℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环，72℃再循环5min。PCR完成后将产物送至生工生物工程(成都)股份有限公司进行测序，测序结束后将结果通过NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）数据库中的BLAST进行菌株的比对鉴定，获得相应的菌株信息。本研究共收集到275株环境微生物（见表2），表2某药企洁净车间环境微生物统计表3结果及讨论3.1环境微生物分布情况本研究表明，某药企洁净车间中占比最高的菌群是革兰氏阳性球菌（50.9%），包括葡萄球菌属和库克菌属，其次为革兰氏阳性杆菌（22.9%），如芽孢杆菌属、微杆菌属及气球菌属，还有革兰氏阴性杆菌（21.5%），如假单胞菌属及不动杆菌属。某药企的微生物鉴定统计结果见表3，其中葡萄球菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、库克菌属均为占比最高的4种微生物，4种微生物之和占比为77.1%。在葡萄球菌属中，共分离到科氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等7种葡萄球菌，具体情况见表4。通过对某药企的持续采样，收集到洁净车间环境的微生物，通过16SrRNA扩增和测序鉴定，初步建立了此药企的洁净车间环境微生物数据库。表3某药企洁净车间环境微生物鉴定结果统计3.2葡萄球菌属分布