新技术在医学实验中的应用内容提纲内容提纲WesternblotWesternblot7Westernblot示例实验步骤：①蛋白质抽提②蛋白浓度测定：按试剂盒说明书，用BCA法测定蛋白浓度。③变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；根据浓度取适量待测蛋白与5x上样缓冲液混匀后,95度变性10分钟,加入上样孔中，浸于电泳缓冲液，以75V（浓缩胶）及120V（分离胶）恒压电泳。④转膜：裁切与凝胶同样大小的NC膜和滤纸，NC膜置于转膜缓冲液中浸泡30min以上。按顺序依次放置滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，半干法以40mA恒流转膜2h。2D-Gel免疫共沉淀免疫共沉淀Chromatinimmunoprecipitation（CHIP）“猎枪”法（Shotgunproteomic）免疫组化Immunohistochemistry17免疫组化样本制备免疫组化的抗体使用不同的探测方法间接探测法介绍：PAP法Avidin-BiotinComplex(ABC)法LabeledStreptavidinBiotin(LSAB)法25免疫组化中的注意要点流式细胞仪流式细胞仪应用举例细胞凋亡、死亡的检测-AnnexinV/PI双染色法1原理细胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性的降低使磷脂酰丝氨酸(Phosphatdylserine)“翻到”细胞膜的外层。荧光标记AnnexinV-FITC(AV)和碘化丙啶(propidumiodide,PI)双染可区分细胞凋亡和坏死,对AV和PI均不染色的是正常细胞,对AV染色对PI不染色的为早期凋亡细胞,对AV和PI均染色的为晚期凋亡细胞或坏死细胞。2结果判断凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。[Ca2+]i的检测－Fluo-3-AM荧光染色原理用荧光探针Fluo-3-AM进入细胞后经非特异性酯酶水解为Fluo-3,后者是钙离子螯合剂,与钙离子形成的复合物经紫外激发可产生荧光,流式细胞仪通过检测其荧光强度而间接反映胞内游离钙水平。线粒体膜电位（ΔψМ）的测定－rhodanmine123荧光染色原理氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功能改变:一是线粒体膜电位降低和线粒体通透性孔开放,二是线粒体产生活性氧。线粒体对rhodanmine123的摄取依赖其膜电位,分析rhodanmine123的荧光强度可反映线粒体的膜电位。激光扫描共聚焦显微(ConfocalLaserScanningMicroscopy，CLSM）②激光共聚焦显微镜一般都有2个以上不同波长的激光管，因此只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析2种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，方便而精确。③激光共聚焦显微镜可以根据科研需要，提供纯荧光、白光、以及荧光与白光合成的图像等多种图像。④以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切片的荧光染色，可获得清晰的图像。3应用㈠定性定量定位荧光分析:CLSM可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。㈡Ca2和pH等细胞内离子的实时定量测定:利用Fluo-3、Fura2等荧光探针，CLSM可以测定Ca2在活细胞内的浓度变化。CLSM可测定单个或一群细胞内的ca2浓度，并提供细胞内Ca2分布的二维及至三维图像。另外，如果对细胞施加外部的刺激，CLSM就能观察到细胞内各点的Ca2浓度在外部刺激下随时间而产生的变化。这对于研究Ca2等离子细胞内动力学有意义。利用SNAFL类探针可对单个或一群细胞内的pH及细胞内pH的变化进行测定。使用双荧光探针Fluo一3和CNARF可进行Ca2和pH同时测定。㈢细胞的物理化学动态监测：CLSM可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定，能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。㈤激光显微细胞外科技术：CLSM可将激光作为“光子刀”使用，