高级生化研究技术实验三PCR法克隆植物基因组DNA目的基因㈡琼脂糖凝胶电泳分离和纯化DNA片段的最常用技术。一块琼脂糖凝胶即为一个包含电解质的多孔支持介质，当把它置于电场中时，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧有富含负电荷的磷酸根残基。DNA分子电泳过程中，有电荷效应和分子筛效应，琼脂糖电泳法分离主要利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。该过程可以通过示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测，分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。㈢PCR技术PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：①变性（Denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链；②退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；③延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。PCR反应体系的确立引物设计三、实验材料与试剂四、实验步骤⑴取材料约100mg，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，将叶片研磨至粉末状。迅速转到1.5mL离心管。⑵迅速加入700ul65℃预热的缓冲液GP1，混匀，65℃水浴20min。⑶加入700ul氯仿，充分混匀，10,000rpm离心10min。⑷取上清至一新离心管，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀。⑸将混匀的液体转入吸附柱CB3中，10,000rpm离心2min，弃废液。⑹向吸附柱CB3加入500ul缓冲液GD，10,000rpm离心1min，弃废液。⑺向吸附柱CB3加入700ul漂洗液PW，10,000rpm离心1min，弃废液。⑻向吸附柱CB3加入500ul漂洗液PW，10,000rpm离心2min，弃废液。⑼10,000rpm离心2min，弃废液，开盖室温放置2min。(10)将吸附柱CB3转入一个干净离心管，向膜中间悬空滴加50ul洗脱缓冲液TE，室温放置2min，10,000rpm离心2min，收集溶液。㈡PCR法扩增目的基因以水稻DNA为模板，分别以PSK-F和PSK-R为上下游引物扩增水稻osPSK基因。⑴反应体系在PCR管中依次加入下列试剂：10×PCR反应缓冲液2μldNTPMixture（2.5mM）1.6μl上游引物（5mM）2μl下游引物（5mM）2μl模板DNA（约10ng）2μlTaq酶（5U/μl）0.2μl加无菌水补充至总体积为20μl。㈢DNA的琼脂糖凝胶电泳检测⑴制胶：称取琼脂糖0.4g，加入1×TBE50mL，于微波炉中加热至完全溶解。冷却到约60℃，在凝胶中加入2L的EB（或替代染料），混匀，倒胶。待胶完全凝固后拔去梳子，转移到装有1×TBE的电泳槽。⑵电泳：取6LDNA样品，加入1Lloadingbuffer，用枪头混匀并点样。开始电泳，电压为4~5V/cm，电泳约30min。⑶观测：把电泳好的琼脂糖凝胶置于紫外灯（或凝胶成像系统）下观测。取6μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。实验四植物组织基因组RNA的提取及检测㈡RNA抽提的基本原理所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。㈢RNase及抑制剂RNase来源内源：材料外源：空气、操作器具、水、人RNase抑制剂类型①RNasin：竞争与RNase结合（反转录）②DEPC：0.05-0.1%，搅拌过夜再灭菌；不能处理Tris溶液及乙烯类制品。③NaOH和H2O2：0.5NNaOH，3%H2O2④异硫氰酸胍：Trizol⑤酚/氯仿：蛋白质变性剂㈣RNA变性电泳RNA的电泳分析与DNA电泳电泳稍有不同。非变性电泳无法测定RNA分子的相对分子质量，这是因为单链RNA分子的某些区段含有互补的双螺旋结构，使得在未变性的条件下，RNA的相对分子质量与泳动速率的相关性较差，只有在完全变性条件下，RNA在凝胶中的泳动速率与相对分子质量的对数成线性比例关系。甲醛电泳是一种理想的RNA变性电泳方法，甲醛可以与碱基形成具有一定稳定性的化合物，同时也可以降低电泳系统的离子强度，这些都有助于阻止RNA分子互补区的碱基配对