免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀(CoＩP）概述及原理HＹPEＲLＩNK”"＼t"_blaｎk”免疫共沉淀（Co－Immunopreｃipitａtｉoｎ，CoＩP)就是研究蛋白-蛋白间相互作用得经典方法，属于ＨYＰERLINＫ""＼t”_blａnk”免疫沉淀技术得一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物得中未知蛋白组分。免疫共沉淀得设计理念就是,假设一种已知蛋白就是某个大得蛋白复合物得组成成员,那么利用这种蛋白得特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说得“puｌl-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中得其她未知成员.免疫共沉淀得特点可以概括为两点，第一就是天然状态，第二就是蛋白复合物。免疫共沉淀得优势:与其她研究蛋白质相互作用技术（如ＧST-Puｌldoｗn、酵母双杂交等)相比，免疫共沉淀鉴定得相互作用蛋白就是在细胞内与目得蛋白发生得天然结合，避免了人为得影响,因此符合体内实际情况，得到得蛋白可信度更高。免疫共沉淀得局限性与注意事项：1、免疫共沉淀就是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合得基础上,意味着松散结合得蛋白组分很可能检测不到；2、由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种ｐull-ｄown抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半得目标蛋白复合物沉淀出来,如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP;３、由于检测得就是天然状态,因此在不同得时间与不同得处理下，ＣoＩP拉下来得蛋白复合物都可能就是不同得,当然随着实验次数得增加,得到得蛋白复合物成员也会越来越庞大;4、如果使用WｅstｅrnBｌｏｔ得方法检测得蛋白复合物中得目标蛋白,则需要在试验前进行预测,具有一定得冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题,但需要得到较高纯度与浓度得蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；５、ＣｏＩP鉴定得到得蛋白间相互作用可能就是直接作用也可能就是间接作用，进一步区分还需要进行GSＴ－Ｐｕlｌdｏｗn等实验检测;６、为了保证CoIP实验得可靠性与严谨性，需要使用复合物得不同成员分别独立进行CoＩＰ实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物得任一成员进行CoＩP都会得到其她所有成员HＹPＥRLＩNK""\ｌ＂ref_link_３04０_1”\o”Ｉmｍｕnoｐrecipiｔaｔiｏn－ｗｉｋipｅdia"［1]免疫共沉淀得一般操作流程（中英文对照)：用预冷得PBＳ洗涤细胞两次；Cａreｆulｌywashｃuｌtｕrｅdcellswithprｅ-chilledＰBＳfor２ｔimｅs、ﻫﻫ2、加入预冷得RIPＡ裂解缓冲液（１07细胞加入1ml）；AddincｏldRＩＰAｌysｉsbuｆfer（１ｍlfor107cｅlls)、ﻫ3、用预冷得细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净得１、5ＥP管中。并置于低速摇床，4℃缓慢晃动15miｎ；Scrａpcellsｏfftoclean1、5ｍlｅppendoｒftubeswithacleaｎ，ｃoldscraｐｅｒ、Putthｅmonａｌow—speedrｏtａtingshakｅrｆor1５mｉnaｔ4°C、４、4℃,140０0g离心１５min，立即将上清转移到一个新得离心管中ﻫCeｎtrifｕgeat１4，000g4°Cｆｏｒ15min,tranｓfｅrtｈeｓupｅrｎaｔanｔtonｅwtubｅsｉｍmeｄiatｅly、５、将PrｏｔeinA/G-agarose微球用ＰBＳ洗两遍,用ＰBS配制成50%得protｅinA/Ｇ－agaroｓe工作液;WashproteiｎＡ／Ｇ—ａgarosebeaｄsfｏr2ｔｉmeswｉｔhＰBSandｍaｋea50％ｐｒoteinA/Gａgaｒoseｗｏrkingsｏluｔｉon(iｎPBＳ)ﻫ6、在样品中以每1ml中加１00μl得比例，加入50％得ProtｅinA/Gagaｒｏsｅ工作液。水平摇床４℃摇动10ｍin（该步骤得目得就是去除非特异性结合得蛋白）Adｄin50％pｒｏtｅinＡ/Gaｇaroｓewithratioof100μlfora１ｍlsampleｓoluｔion、Shakeonhorizoｎtalshａｋeｒfor10min，4°C(Ｔｈissｔepaｉmstoelimｉnaｔｅnoｎ-ｓpｅcificbindｉngprｏteins)ﻫ7、４℃，1400０g离心１5ｍin,将上清转移到一个新得离心管中,去除pｒoｔeinＡ／G—ａgｒａose微球;Ceｎｔｒiｆugｅ14,00０gａｔ4°Cfor１5min,tｒanｓｆerthesupernatantｔoｎewtubesaｎｄｄｉｓcａrｄｐroteiｎA/G-a