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种质资源保存:利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源,使个体中包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力,并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。种质资源超低温保存(Cryopreservation)是将植物的细胞或组织经过防冻处理后,在-80℃以下的超低温下保存的方法意义可以在有限空间内保存大量资源与种子保存相比,可以不受时间和高含水量的限制与试管苗相比,可以避免频繁继代而带来的变异,同时节省工作量用于离体保存的植物材料愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等超低温保存的植物种类超低温保存已涉及到很多植物种类(谷类、豆类、薯类、树木、藻类等等)据王君晖等(1998)统计,目前已有40多个属60多个种的木本植物被进行了超低温保存试验在超低温储藏中,植物材料不仅能长期保持形态发育的潜能,还能保持遗传性状的稳定,适用于对植物材料进行短、中、长期保存,使迄今唯一的、不需要继代的、可靠的长期保存方法。随着保存技术的发展,运用复合程序的超低温保存技术不断涌现,对一些体积较大的组织进行保存将成为可能,且保存过程对材料的伤害越来越小。因此,超低温保存技术为种植资源保存提供了一条新的途径。细胞内外水的冻结特性植物细胞中的水由游离水和束缚水组成,其中游离水约占90%,很容易冻结理论上讲,细胞外水的冻结温度为-5℃~-15℃,细胞内游离水的冻结在-25℃,而结合水在-100℃下也不会冻结根据Luyet的冻结理论,细胞内游离水的冻结温度可以认为是细胞冻存的安全温度,一般将-30℃视为一些技术研究的基础温度控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键细胞超低温贮存一般要经过:预冻→超低温长期储存→解冻细胞致死损伤一般发生在预冻和解冻两个环节上避免细胞致死损伤是超低温保存技术研究的重点直接快速冷冻该方法是将材料从0℃,或者其它预处理温度直接投入液氮。其降温速度在每分钟1000℃以上高度脱水的植物材料,如种子、花粉、球茎和块根,以及抗寒性较强的木本植物的枝条或芽,经过冬天的低温锻炼可以采用快速冷冻法两步冷冻法两步法第一步:降温至转移温度。样品在添加冰冻保护剂后,用可控速率的降温设备(程序降温仪),以某个速率(0.1~0.5℃/min),将样品降温至转移温度(一般是-40℃~-70℃)第二步:将处于转移温度下的样品投入液氮贮存逐级冰冻法将经保护剂处理的材料在0℃预处理后,依次通过不同温度的冰浴,如-10℃、-15℃、-23℃、-40℃等。一般每级约停留5min,然后浸入液氮简成令等(1987)将甘蔗愈伤组织在0℃的冰冻保护剂(10%DMSO+0.5mol/L山梨醇)中预处理30-45分钟,接着用1℃/分钟的降温速度从0℃降到-40℃,停留1-3小时,投入液氮中保存,半年后仍可再生大量植株玻璃化(Vitrification)是指液体转化为非晶体(玻璃态)的固化过程根据物理学原理将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固,形成无规则的玻璃化固体,将玻璃化液和材料一起处理一段时间以后再投入液氮中,此时冰冻保护液和材料一起进入玻璃化状态。玻璃化操作简单易行,适用于茎尖、合子胚等组织和器官;但玻璃化液对材料有一定毒害作用。使溶液玻璃化有两条途径:一是大幅度提高冷却速率;二是增加溶液浓度干燥法:利用无菌空气流、干燥硅胶饱和溶液的气相等对样品进行脱水,然后将样品快速投入液氮贮存(合子胚或胚轴)预培养法:将保存材料在含有冰冻保护剂的培养基上预培养一段时间,以诱导脱水。然后将脱水材料浸入液氮中保存(合子胚和顶端分生组织)五、包埋冻存法优点:材料包埋后再进行预培养与干燥,增强了材料对干燥脱水和骤冷的抗性使一些含液泡的外植体也可以进行液氮保存材料的基本特性材料的基本特性包括基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同植物细胞培养物的生理状态是决定冻后细胞存活率的重要因素之一。指数生长期和滞后期的细胞抗冻力强,存活率高预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料,减少了细胞内自由水的含量,使细胞能经受低温胁迫,减少或避免了冷冻伤害,可大大提高材料的抗冻力预处理包括增加材料中的糖浓度、提高渗透压、减少细胞内自由水的含量、在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂,如0.3~1.0mol/L蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透调节剂,5~10%DMSO等冰冻保护剂冰冻保护剂(Cryoprotectiveagent,CPA)也称抗冻剂,对生物体低温保存必不可少冰冻保护剂应具有易溶于水,对细胞无毒,容易从组织细胞中清除等特点冰冻保护剂的作用是增加膜透性,加速细胞内自由水向外流动实现适度脱水;降低冰点,提高溶液的粘滞性,阻止冰晶生长,降低低温伤害渗透型渗透型冰冻保护剂保护机制:在