第六章基因工程原理第一节基因工程的概念及其主要内容基因工程(geneengineering)常和以下名称混用二、基因工程的主要内容或（步骤）三、基因工程技术及其应用转基因植物转基因动物作为生物发生器基因本身也是一个产业蛋白质工程的概念蛋白质工程主要内容酶工程的概念酶工程的主要内容发酵工程概念发酵工程技术生物技术的应用领域生物技术产业化生物制药产业化特点基因工程试剂的高回报美国生物技术产业发展情况美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）基因治疗人数情况生物技术产业化—农业领域世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物种植面积生物技术与传统中药第二节基因工程中的工具酶一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途酶切图谱的构建（a）酶切图谱的构建（b）二、DNA甲基化酶（一）、甲基化酶的种类与识别顺序2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响１）抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)２）抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）３）抑制不同种限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途１）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成２）在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切三、核酸酶（一）、外切酶III（ExoIII）3.外切酶活性特点1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：C>>A-T>>G3)反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解4.用途1)核酸（DNA）标记2)基因突变----缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)ds-DNA结构:切口,缺口,断口（二）、Rnase（三）、RNaseH（四）、DNaseIMn++存在时四、DNA聚合酶3.用途1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段（二）、T4DNA聚合酶（三）、TaqDNA聚合酶TaqPol和PCR五、连接酶5’-AAGCTT-3’5’-AOHPAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAPHOA-5’HOATTCGAP退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’或5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’T4DNA连接酶5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’或5’-AAG