荧光原位杂交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，开展个体化药学服务，就使用特异性位置探针，检测特定的SNP位点。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。1）间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大。2）直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合。直接标记法在检测时步骤简单，可以直接检测荧光信号。开展个体化药学服务，即采用荧光直接标记法。**荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。**FISH有上述优点的原因：使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：（1）间接标记：生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)——半抗原报告分子（2）直接标记：荧光素用荧光检测仪和荧光染色原位杂交，实现SNP分型的原理仪器原理：A1（探针1）+B（模板）A1B（杂交分子）A2（探针2）+B（模板）A2B（杂交分子即：（1）当探针多，模板少时，探针间竞争与模板结合。（2）完全互补配对的探针结合力强，形成的杂交荧光信号强。（3）一个碱基不互补配对的探针结合力较弱，形成的杂交信号较弱。A1（探针1）+B（模板）A1B（杂交分子）A2（探针2）+B（模板）A2B（杂交分子A1由于获取信号的时间ST的差值体现了两条探针与模板的相互关系，因此，可以有以下情况：DeltaST=STA1-STA2（1）模板与A1完全互补（A1配对碱基的纯合子），与A2不完全互补时：DeltaST1=-7（2）模板与A1、A2探针都完全互补（A1、A2配对碱基的杂合子）时：DeltaST2=1（3）模板与A2完全互补（A2配对碱基的纯合子），与A1不完全互补时：DeltaST3=8ST阈值的设定：（1）取DeltaST1与DeltaST2之间的中位数（-7+1）/2=-3（2）取DeltaST2与DeltaST3之间的中位数（1+8）/2=4.5（3）从而获得取Delta阈值的下限-3，上限4.5。由此，可根据阈值自动判断原位杂交荧光染色的基因型（1）DeltaST小于阈值下限-3，即为A1探针杂交阳性，模板为A1对应碱基的纯合子。（2）DeltaST介于阈值下限-3和阈值上限4.5之间，则为A1、A2探针杂交均阳性，模板为A1、A2探针对应的碱基的杂合子。（3）DeltaST大于阈值上限4.5，即为A2探针杂交阳性，模板为A2对应碱基的纯合子。（1）就像HPLC,同一个样品，同一个流动相条件，连续进六针，洗脱曲线都不会一致，需要用内参来标定。（2）荧光染色原位杂交检测，每次的荧光信号也变动，因此，需要用参比模板和试剂进行结果的校正。软件参数设置软件参数设置目前软件只检测两条荧光通道，通道一（FAM通道）和通道二（HEX通道），软件首先计算检测荧光的荧光强度（软件里叫做一阶导）。如果计算出来的荧光强度大于软件里设置的数值（通道一阶导阈值），软件认为这个通道的荧光数据是有效的，进而计算ST值；如果计算的荧光强度小于设置的数值则认为是无效的数据，略过，ST会显示成0或者-1。如果两个通道的荧光强度均小于所设置的数值，软件显示为“重测”。2：根据ST（杂交时间）差值来判断二：参数设置方法二：参数设置方法天隆软件一阶导设置2：根据质控数据进行St值上下限设置实验过程中可能出现