一基本原理限制性核酸内切酶（restrictionendnuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。在同源染色体相应的DNA区段，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，缩写为RFLP）技术。这一技术主要包括三大步骤：1、靶DNA的准备先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将DNA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。2、核酸探针的标记将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。探针的获得最先用内切酶处理植物的DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。3、杂交显示将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分析。三RFLP技术的应用实例2.DiseaseStatusifbothparentswereheterozygous,theycouldhavechildrenwithanyofthethreegenotypes,thoughheterozygouschildrenwouldbetwiceaslikelyaseitherofthehomozygousgenotypes.3.GeneticMappingInthisexample,70%oftheprogenywereproducefromparentalgenotypeeggsand30%wereproducedbyrecombinantgenotypeeggs.Therefore,thesetwoRFLPlociare30centiMorgansapartfromeachother.四RFLP技术的优点及注意的问题第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异性，不受环境条件及基因互作的影响。第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群体就能构建一个较丰富的RFLP图谱。2、在做RFLP分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意：第一，作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象；第二，在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠；第三，被消化的DNA浓度不能太高；第四，电泳时要用低压电泳；第五，杂交前探针必须充分变性；第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交和洗膜的条件；第七，作放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性等因素决定曝光的时间。五RFLP在作物遗传育种上的应用谢谢！