一、酶制剂及其底物辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)HRP酶促反应HRP常用底物碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)，AP常用底物作为酶标记对象的抗原与抗体要求：制备方法要求：（1）技术方法简单、产率高，重复性好；（2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；（3）酶标记物稳定，不形成聚合物。二、酶结合物的制备方法（一）过碘酸盐氧化法1、HRP标记腹水单抗10、将交联物过SephdexG200（2.6×100cm）层析纯化，分管收集第一峰。2、HRP标记多抗6.将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜。7.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。8.3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。9.将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物。（二）戊二醛交联法HRP标记多抗4、加入0.1mL1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h。5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。6、装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2PBS，4℃透析过夜，或通过SephadexG-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液。本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点：酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。注意事项第四节酶免疫测定技术要点一、基本概念加样：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。温育：常采用的温度：43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）。洗涤：是ELISA最主要的关键技术，目的是分离游离的和结合的酶标记物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。显色：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸终止；TMB显色终止液：叠氮钠、SDS、各类酸性终止液。比色：以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。ELISA常用溶液：标记抗体质量判定直接ELISA法测HRP-IgG效价标记抗体质量判定用于ELISA酶标抗体的各项指标参数HRP含量（mg/ml）三、包被抗体工作浓度确定15F3四、酶标抗体工作浓度确定阳性吸光值达1.0以上，阴性对照吸光值低于0.1时，酶标抗体最大稀释度为1∶500。因此，酶标抗体HRP-13A4的工作浓度为1∶500。五、最适抗原包被浓度的优化