第五章第一节概述细胞学说细胞培养是将细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。细胞培养已有近百年历史了。随着细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术的发展，逐渐形成了细胞工程学。细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。第二节动物细胞的形态和生理特点1、贴壁细胞细胞在表面上生长时有两种形态，成纤维样细胞型和上皮样细胞型。成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞成骨细胞等。上皮样细胞型主要来源于外胚层和内胚层组织细胞，如皮肤细胞、肠管上皮细胞，在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。贴壁细胞单层培养的优点细胞贴壁的表面处理可以使用三种物质单层培养的放大2、悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。3、兼性贴壁细胞根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。二、动物细胞生理特点2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。大多数二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附，伸展后才能生长繁殖，机制并不清楚，当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即细胞与周围细胞接触时，细胞就停止增殖—接触抑制，若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除。3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。正常二倍体细胞传代培养都是有限的，大约在50代左右，然后细胞就会逐渐死亡，但在培养基中加入表皮生长因子或经自然和人为的因素转为异倍体后该细胞可转变成无限细胞系，更适合于工业生产。4、动物细胞对周围环境十分敏感物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感。5、动物细胞对培养基要求很高原核生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长；而动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素，多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子。6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面型内质网上都可以进行，内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，需要糖基化，而细菌细胞则没有糖基化过程。动物细胞作为宿主细胞生产药物的优点和缺点：第三节生产用动物细胞的要求和获得二、获得2、二倍体细胞原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。特点：二倍体；有明显的贴壁和接触抑制特性；有限的增殖能力；无致瘤性。3、转化细胞系通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。优点：无限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低，适合于大规模工业化生产。三、生产常用动物细胞的特性BHK-21：从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。Vero：从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细胞，用于制备疫苗。Namalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。四、基因工程细胞的构建和筛选1、真核细胞基因表达载体的构建构建穿梭质粒载体的基本成分：允许载体在细胞内扩增的质粒序列；含有能使基因转录表达调控元件；能用以筛选出外源基因已整合的选择标记；有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。2、载体的导入和高效表达工程细胞的筛选磷酸钙沉淀法电穿孔法五、细胞库的建立原始细胞库应有详细档案：1、该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料。2、该细胞的特性：形态、生长特性。3、对各种有害因子的检查结果，细菌、真菌、支原体和各种病毒。第四节动物细胞的培养条件和培养基3、保证有适量的氧气供应；4、需随时清除细胞代谢中的有害产物；5、有良好的适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；6、及时分种，保持合适的细胞密度。二、动物培养基的种类和组成血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。2、合成培养基合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加5%-10%的小牛血清，才能使细胞很好地增殖。添加小牛血清的作用3、无血清培养基无血清培养基的优点第五节动物细胞培养的基本方法一、细胞分离2、消化分离法二、细胞计数三、细胞传代四、细胞的冻存和复苏冻存中应注意的事项复苏第六节动物细胞的培养方法和操作方式1、悬浮培养2、贴壁培养3、贴壁-悬浮培养包埋和微曩