第三章生物制品的制备P62NP80一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法（1）原料选择原料的选择原则：①有效成分含量高，新鲜；②原料来源丰富，产地较近；③原料中杂质含量少；④原料成本低等。①植物原料生长的季节性；②微生物原料的对数期；③动物原料的年龄与性别。①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。②植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。细胞破碎动物细胞:多分泌到细胞外培养液植物细胞:多为胞内产物微生物（细菌/真菌）:胞内、胞外对于胞内产物需要进行细胞破碎。胞外：大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。胞内：有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。细胞破碎方法一、机械破碎方法二、物理破碎方法物理破碎法的分类三、化学破碎方法四、酶学破碎方法自溶作用（2）提取（extraction）生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：1.沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等。2.超滤法和透析法、凝胶层析法、超速离心法等：按分子大小分离的方法。3.离子交换层析、电泳法、等电点聚焦法等是按分子所带电荷进行分离的方法，氨基酸、多肽、蛋白质、酶均具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。4.亲和层析法大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。基因工程产物的特点：产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎产物浓度较低，杂质多，提纯困难产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活1.含目的产物的起始物料的特点①菌种类型及其代谢特性。②原材料和培养基的来源及其质量；③生产工艺和条件。④初始物料的物理、化学和生物学特性。目的产物的表达特性。目的产物本身的分子特性。目的产物的用途和需求量。分离纯化的基本过程分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。分离纯化一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。1、根据产物表达形式来选择分泌型表达产物：发酵液的体积很大、但目标产物浓度较低，必须在纯化前进行浓缩，可用沉淀和超滤的方法浓缩。产物在周质表达：为了获得周质蛋白，E.coli经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透压裂解的方法来获得，能够回收到高质量的产物。可溶性表达产物：破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。分离单元之间的链接：Ｐ80，ＮＰ100①先选用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；②随后采用高分辨率的操作单元（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；③凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后。分离纯化工艺应遵循以下原则：（1）工艺条件应温和，具有良好的稳定性和重复性：不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，在任何环境下使用都应具有重复性，明确需严格控制的步骤和技术（2）尽可能减少组成