粗蛋白含量的测定（凯氏定氮法）讲解人:段慧粗蛋白含量的测定蛋白质的定量分析是蛋白质结构分析的基础，也是农副产品品质分析，食品营养价值比较、生化育种、临床诊断的重要手段。现有多种蛋白质的定量法，都是根据蛋白质分子的理化性质进行的。这些方法大体可分为利用蛋白质的共性（含氮量、肽键、折射率等）和利用蛋白质含有特定氨基酸残基（芳香族、酸性、碱性等）两类。蛋白质的常用定量法物理法(折射率法、比浊法、放射性同位素法)蛋白质定量法利用共性凯氏法双缩脲法Lowry法比色法利用特定氨基酸残基紫外法色素结合法蛋白质的常用定量法凯氏法是1883年丹麦化学家凯道尔（Johankjedahl）创造的对蛋白态氮定量的方法，目前在国际上仍被列为蛋白质定量的基准方法。双缩脲法、Lowry法、紫外法是目前生化领域中使用较多的比色法。色素结合法是40年代以后发展起来并且仍在急速发展的新的比色法，其灵敏度极高。一、凯氏定氮法原理每一种蛋白质都有其恒定的含氮量。各种蛋白质含氮量变幅在14%－18%，平均为16%。当样品与浓硫酸加热时，样品中蛋白质的氮变成铵盐状态。在强碱条件下将氨蒸出，用加有混合指示剂的硼酸吸收蒸出的氨。以标准盐酸或硫酸滴定吸收的氨，恢复硼酸吸收氨之前原有的氢离子浓度。根据标准酸消耗量，即可算出氮量，再乘以16%的倒数即6.25，可求出样品中蛋白质的含量。。一、凯氏定氮法原理有机物样品?浓H2SO4???(NH4)2SO催化剂Δ4?CO2??SO2??SO3?(NH4)2SO4?2NaOH?2NH4OH?Na2SOOH?4NH4OH???H2O?NH?NH?H3BO43?34?(NH4)H2BO442(NH)H2BO?H2SO4?(NH4)2SO4?2H3BO4二、仪器和试剂1.日本VS－KTP自动定氮仪2.红外温控定时消解炉3.样品粉碎机4.玻璃消解管5.硼酸（A.R）6.甲基红7.亚甲基兰三、测定步骤称样在样品消解时为定氮仪添加试剂：标准酸、氢氧化钠硼酸、混合指示剂输入有关参数水、加碱量、蒸馏时间换算系数、称样量等消解上机测定三、测定步骤1.称样取0.1~0.5g粉碎均匀的样品或吸取液体样1~5ml，分别置于三支消解管中，加入催化剂（硫酸钾与硫酸铜为9:1）1.5~2g，加入浓硫酸3~5ml。*含硝态氮的样品须处理，称样0.1g，加入含水杨酸的硫酸3ml，放置30分钟后，再各加0.1g锌粉，最后再加2mlH2O，放置10分钟后，加入催化剂。**样品处理注意事项1.称样一定要精确，样品一定要均一，因为此方法用的是半微量凯氏定氮法，样品用量较少。2.为防止样品粘在管壁上，应采用称量纸包样，直接将投入消煮管底部，做空白时，带上称量纸，抵消其影响。2.称样量大小决定于各类样品的含氮量。如健壮茎叶干样含氮约1~5%，称样应为0.2g，老熟秸秆干样含氮约0.4~0.6%，称样量为0.5g，种子干样含氮约1~4%，称样量应为0.2~0.5g，新鲜的茎叶样品可按干样称量的5倍称取。**样品处理注意事项4.浓H2SO4的用量主要取决于称样的干物质的重量。小于1g的干物质至少加3~8mlH2SO4，每增加1g干物质需增加6~12mlH2SO4。5.如果条件允许的话，样品加酸以后浸泡2小时或者过夜更好。三、测定步骤2.消解将上述样品置红外消解炉上200℃30分钟，直到样品中没有大的结块，400℃30分钟，消解后溶液呈清亮的蓝绿色*消煮的温度不能超过410℃，否则将会引起氮的损失。三、测定步骤3.为定氮仪添加试剂(1).配制经标定的标准酸（硫酸或盐酸）浓度为0.01~0.05mol/L放入盛标准酸的容器中。三、测定步骤(2).将配制好的30%氢氧化钠溶液置入塑料碱桶中。三、测定步骤(3).将配制好的3%的硼酸按100:1的比例加入混合指示剂（A液：0.2%甲基红无水乙醇；B液：0.1%亚甲基兰无水乙醇溶液；两溶液以1:1混合后加入），溶液配好后置于棕色瓶中。三、测定步骤4.输入有关参数打开仪器的电源开关，通入冷却水以及供锅炉使用的去离子水，参数输入输入有关参数（如水、加碱量及蒸馏时间，换算系数、称样量等）三、测定步骤计算系统蒸馏头5.加样将已消解好的样品放入蒸馏室，即可自动蒸馏、滴定、比色、换算结果）。蒸馏系统打印系统蒸馏管比色滴定系统四、结果计算141000(V?V0)?C粗蛋白%?V——