凋亡细胞的形态学和生化特征：细胞皱缩质膜出泡染色质浓缩DNA裂解：DNAladder磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧凋亡小体的释放核酸内切酶活化与DNA片段化是凋亡的生物化学标志。DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当核酸内切酶在核小体连接部切开DNA时，即可形成180～200bp或其整倍数的DNA片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征的阶梯状（ladder）条带，是判断细胞凋亡的客观指标之一。DNAladder细胞凋亡过程（四个阶段）：1.凋亡信号转导2.凋亡基因激活3.凋亡的执行（由DNase和caspases执行）4.凋亡细胞的清除。凋亡诱导因素作用于细胞转化为凋亡信号胞内信号转导途径激活细胞死亡程序细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体等）。细胞凋亡的三条通路半胱天冬酶（胱冬酶，Caspase，Cysteine-containingaspartate-spicificprotease）Caspase的分类Caspase的底物Caspase的作用在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”。Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信号传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。但并非所有的凋亡过程都有caspase的参与。Hela细胞培养至70-80%接合，加30μL大蒜素，培养2hr.↓去除培养液，加PBS500μL，细胞刮刀刮出细胞吸至EP管，再用PBS500μL洗平皿，2000rpm离心2min，弃上清.↓PBS洗1遍，离心收集细胞（2管）DNALadderCaspase-3活性检测细胞沉淀中加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细胞重悬于PBS中。↓加入4微升RNaseA，Vortex混匀。室温放置2分钟↓加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀↓加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟（加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合）↓加入200微升无水乙醇，Vortex混匀（加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内）↓把上述混合物加入到DNA纯化柱内，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。↓加入500微升洗涤液I，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。↓加入600微升洗涤液II，12000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。↓12000rpm离心1分钟，以去除残留乙醇↓将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50μL洗脱液。室温放置3分钟。↓12000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化得到的总DNA。（洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收）将抽提得到的DNA50μL+10Loadingbuffer6μL，混匀，上样进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。电压60V，时间3-4hr，观察DNAladder的形成。Caspase-3活性检测Bradford法测定样品蛋白浓度样品中caspase3催化生成的pNA的吸光度（y）=样品的A405-空白对照的A405↓通过标准曲线公式：y=0.0025x+0.0103，求出样品中催化产生的pNA的量。↓样品单位重量蛋白中所含caspase3的酶活力单位=样品中酶催化产生pNA的量/待测样品蛋白浓度预试结果：DNALadder蛋白浓度测定标准曲线