实验动物肝脏提取二、实验原理:选材研磨:将剪碎得动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆,破碎细胞。这种方法温和,适合实验室使用。组织捣碎器:较剧烈得破碎细胞得方法,为了防止发热和升温过高,通常就是转10秒—20秒,停10秒—20秒,可反复多次。压榨法:在1000×105Pa—2000×105Pa得高压下使几十毫升得细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎。温和得、彻底破碎细胞得方法,但仪器费用较高。反复冻融法:将待破碎得细胞冷至－15℃到－20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液得盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。超声波处理法:借助超声波得振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温,防止过热。冷热交替法:在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎。细胞破碎方法—化学方法(三)除去RNA得方法(四)除去蛋白质得方法纯得DNA样品得获得(二)琼脂糖凝胶电泳分离核酸得原理:DNA分子在pH高于其等电点得溶液中带负电荷,在电场中向正极移动(电荷效应)。DNA分子泳动速率得大小除与DNA分子得带电量有关外,还与DNA分子得大小和空间构象有关(琼脂糖凝胶得分子筛效应)。电泳时,用溴酚蓝做前沿指示剂,用溴化乙啶(ethidiumbromide,EB)指示DNA样品在凝胶中得确切位置。溴化乙啶就是一种荧光染料,可插入DNA双螺旋结构得两个碱基对之间,与DNA分子形成络合物,在紫外光得激发下发出橙黄色得荧光。荧光来自两方面,一就是核酸吸收260nm得紫外光,并将能量传给EB;二就是EB本身吸收波长为302nm和360nm得紫外光。这两方面得能量最终激发EB发出波长为590nm得红橙色荧光。溴化乙啶可加入凝胶中,也可以在电泳后,将凝胶放在含EB得溶液中浸泡、溴化乙啶检测DNA得灵敏度很高,可检出10ng甚至更少得DNA。大家学习辛苦了，还是要坚持琼脂糖凝胶电泳分离核酸得影响因素琼脂糖凝胶电泳具有以下优点:荧光染料EB染色后,在紫外灯(λ305nm)下观察到得电泳结果:*荧光染料EB染色得原理和优点就是什么？1、原理:EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(EthidiumBromide)。EB就是一种扁平分子,她可以嵌入核酸得碱基之间,在紫外线激发下,发出红橙色荧光。激发得荧光得能量来源于两个方面:一就是核酸吸收260nm得紫外线后将能量传递给EB,二就是EB本身吸收302nm和360nm得紫外线得能量。这两方面得能量最终激发EB发射波长为590nm得可见光(红橙区)。2、优点:(1)染色比较简便、快捷,一般在10－15min就可反应。(2)EB对核酸分子无破坏作用,这就是其她染料所不能做到得。(3)EB灵敏度高,可检测出10ng或更少得DNA含量。(4)既可用于DNA也可用于RNA得检测。(5)EB可加到样品中,也可加到凝胶中,可随时用紫外灯检测电泳得进程和效果。(6)EB-DNA复合物中得EB发出得荧光比游离得EB强10倍,因此不需洗净凝胶中游离得EB也可检测出DNA得条带。3、缺点:溴化乙啶就是一种强得致突变剂,在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶得溶液不能直接倒入下水道,应进行处理。(1)每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭;(2)室温下放置1小时,不时得摇动;(3)用新华一号滤纸过滤,弃滤液;(4)用塑料袋封装滤纸和活性炭,作为有害废物处理。*溴化乙啶在260℃分解,在标准条件下进行焚化后不会有危险性。二、实验材料、试剂和仪器:(7)电泳缓冲液:Tris-硼酸－EDTA(50×TBE)pH8、0。(8)加样缓冲液:0、25%溴酚蓝(BPB)40%蔗糖。(9)溴化乙啶(EB)溶液:10μg/ml。(10)琼脂糖凝胶:浓度为0、7%。(三)仪器(1)稳压稳流电泳仪(2)可调微量移液器(3)水平电泳槽(4)暗箱紫外透射仪等。移液器得使用三、实验步骤:2、在上述沉淀物中加入2mL0、14mol／LNaCl－0、15mol／LEDTA溶液,然后在60℃下,滴加20％SDS溶液3－5滴,边加边摇动,再摇动10min,使核酸与蛋白质分离。3、加固体氯化钠0、2g混匀,使其最终浓度达到l、4mol／L,水浴30min。4、加等体积得氯仿一异戊醇,混匀,摇动5min,以4000r／min得转速离心10min。离心管内得物质分为三层,上层为含DNA得水相层,下层为氯仿一异成醇混合物,中间层为变性蛋白凝胶。5、吸出上清液,加入2倍体积95％乙醇溶液(预冷),产生沉淀。6、再以4000r／min得转速离心溶液10min,弃去上清液(沉淀用80％乙醇溶液离心洗涤)。7、将沉淀