基本概念二、常用的免疫标记物质酶标仪荧光显微镜FCM检测分析细胞表面受体的表达β液闪仪γ计数器金免疫技术吸水纸化学发光免疫分析技术标记免疫技术的分类均相型（homogenous）反应完成后，不用分离结合与游离的标记物第八章酶免疫技术本章要求酶免疫技术的基本原理酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被测物进行定性或定量的标记免疫技术。在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点，而且，可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法。酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)方法类型及基本原理一、双抗体夹心法（二）双位点一步法（三）双抗原夹心法测抗体四、间接法①特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质；②加待测血清，血清中若有相应的抗体则与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后，固相载体上仅剩下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质不能与固相抗原结合被去除；③加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体）与固相复合物中的抗体相结合。洗涤后，固相载体上的酶量与待测血清中特异性抗体的量相关。若欲测人对某种病原微生物的抗体，可用酶标记羊抗人IgG抗体；④加入底物显色，颜色深浅代表样本中待测抗体量。五、竞争法六、捕获法测IgM抗体①抗-μ链（或抗-IgM抗体）包被在固相上，形成固相抗-μ链（或抗-IgM抗体），洗涤；②加入稀释待测样本，样本中所有的IgM与抗-μ链结合，洗涤除去未结合物质；③加入特异性抗原，它只与固相上特异性的IgM结合。洗涤；④加入针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上抗原结合，洗涤；⑤加底物显色，若有颜色显示，则表示待测样本中有特异性的IgM抗体存在。七、中和法常用于已知中和抗原检测样本中的未知抗体。在固相上包被已知抗体，当检测样本中含有待测抗体时，与反应体系中加入的中和抗原结合，反应过程不能形成“抗体-抗原-酶标记抗体”复合物，加入底物不显色，实验结果判为阳性；当检测样本中无待测抗体时，加入的中和抗原则与固相抗体结合，形成“抗体-抗原-酶标记抗体”免疫复合物，加入底物显色，实验结果判为阴性。固相酶免疫测定的技术要点试剂的准备常用酶及酶的底物交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-1--戊二醛--2-抗体（抗原）1=2同源双功能交联剂戊二醛1=2异源双功能交联剂羟琥珀亚胺酯戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm，而聚合体则在235nm，故新鲜的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛应避光.低温保存。测定方法的标准化包被包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。包被用抗体IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。包被条件封闭（二）加样定量测定加样量应力求准确，加样时应将液体加在孔底，力求不产生气泡。样本和结合物的稀释应按规定配制。一般100µl/孔（三）洗涤洗涤是决定实验成败的关键。其目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。Tween20在ELISA中最为常用，洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。常用PBS-Tween20。洗涤步骤孵育(incubation)终止反应（五）结果的判定酶免疫组织化学技术（EIHCT）标记抗体免疫组织化学技术非标记抗体酶免疫组织化学技术技术类型酶标记免疫电镜技术免疫印迹法β液闪仪γ计数器金免疫技术第八章酶免疫技术在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等