细菌质粒提取质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。去除RNA相对比较简单，首先是使用RNase消化(抽提中或者抽提后)。经过RNase消化后，RNA变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得RNA，则需要更烦【如何去除RNARNA】琐的操作。基本上是采用两种办法：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组DNA从细菌中出来，从而将质粒和基因组DNA分开；二是利用NaOH/SDS完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组DNA都从细菌中出来，再利用质粒和基因组DNA在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组DNA分开去除蛋白质及其它杂质】基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如CsCl超离心。/【实验前方法/试剂的选择】首选方法是碱裂解法。如果有问题，或者是大质粒(>15kb)，则用温和的方法SDS裂解法。详细情况见“分子克【如何将质粒与细菌基因组DNA分开】隆”。试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。【关于碱裂解法】质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。关于碱裂解法的原理，复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论，大家可以去看一下。这是一篇美文，非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了(电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。)。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。(似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能100%配对复性。)碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着盍呀馐奔涞难映ざ档停孀耪吵矶鹊脑黾佣醯驼飧鱿窒螅耆梢?使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过，但QIAGEN抽提大质粒用的就是碱裂解法。8【质粒抽提的8大窍门】1：摇菌时间-过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。2：起始菌体量-大家习惯说“从多少ml菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的3：菌体的彻底悬浮-如果没有彻底悬试剂量，都只与菌体量有关。浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在溶液III加入后，会有4：一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。使用相对过量的试剂-这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一5：裂解时间-加入溶液II后，混匀，体系最好能立即变点菌体。得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液III中和。如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。6：中和的操作-在1.5ml离心管中加入溶液III后，先颠倒两次，使管7：中和底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。后的离心去蛋白-一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。【降低RNA残留的方法】RNA的去除，首先是使用RNase消化。在溶液I中加入高浓度的RNaseA(100ug/ml)，或者用含25ugRNaseA/mlTE溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA的残留并不影响酶切等最常用的用途。如