质粒提取原理(|8E+e7D5h-e:U&R1C质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。3^9_2x5z(V#k;C从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。#G8M&T%U8s1[/B#|在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。2J&K#a%s6P/O!D质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的SCDNA走在最前沿，OCDNA则位于凝胶的最后边；道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OCDNA和SCDNA之间。质粒小量提取之细菌的培养及收集4z&[&}!W7n6~:b3v试验准备：%B.E7s+?4z"h1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。&O1T;j(].d)P4X2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。0k!]7^)y&D3o&z3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。6R(b%f6j*Ci'q5J&T+t0H/x试验步骤：-R$~6a%?'m#o'D.T+P将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃培养12-24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。3g+J(T$?&s1K"v/v*d质粒小量提取之碱裂解法3L/T"F5^0Z$`%n)i0l5o试验原理：3E3G&B/R"{#t碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。;V/n&\2q1X4[!Z试验准备：%Q#i9^9UO$S(N)S1、溶液Ｉ:pH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10lbf/i-\0U/O!D+\'t'?8B.x2C)xn2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子'f"j6~4J#z*T&j0N的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋和Mg2＋等二价金+Q:N3\.Y:G.V属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase1p,A1h*u%z(W,i,A,a+h:w对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。&i]+^*m-P0X:J-c0_2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的2A6J-j)|"{5JCO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是