感受态细胞的制备1、实验准备a）、常规：酒精灯，接菌环，试管架，LB固体/液体培养基,10ul、200ul、1000ul、5ml枪，冰及冰盒，连接产物b）、高压：饭盒（内含有吸水纸，1.5~2mlEP管、10ul、200ul、1000ul、5ml枪头）、50ml离心管c）、相关溶液配制：、配置0.1mol/l的氯化钙（1.11g定容到100ml，用过滤器过滤）4℃保存。、配置LB固体平板、100mlLB液体、2~3个5mlLB液体第一天菌种复苏A、准备：甘油菌、LB（kana+）平板、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：取-800C保存的甘油菌种，用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将粘附在接种环上的细菌划在LB平板平面，将冻结的培养物放回-800C保存，平板于370C培养过夜（12~16h）第二天增菌准备：含有单克隆菌落的LB平板、5mlLB菌液、酒精灯、打火机、接种环、标记笔操作：挑取大小适宜的单克隆接种于5mlLB液中；180rpm,370C,12~16h振荡培养注意：细菌复苏非常重要，如果细菌生长不好，可再次将5ul菌液接种于3-5ml培养基中，震荡培养过夜。第三天增菌A、准备：DH5a过夜菌液、酒精灯、打火机、试管架、标记笔、200ul、1000ul枪及枪头100mlLB菌液+500~1000ul过夜菌液；B、操作：将过夜菌液于2500rpm,37℃,振荡培养3h。感受态细胞制备准备：天平，冰块，烧杯（冰水浴用）,饭盒（内含吸水纸，EP管）,计时器，标记笔50ml离心管，1000ul、200ul，5ml枪及枪头；0.1mol/l氯化钙，100mlDH5a菌液B、实验流程：1、将100ml菌液分别移至4个50ml的离心管中（不要太满，可用2个50ml离心管分两次收菌）配平，冰水浴10min。2、离心，4100rpm,4℃，10min，同时将氯化钙放在冰盒上预冷。3、在无菌操作台内弃去上清液，将管倒置在吸水纸上1min。4、加氯化钙清洗（每50ml初始培养物用10ml氯化钙），吹打，混匀。5、4100rpm,4℃，10min。6、在无菌操作台内弃去上清液，将管倒置在吸水纸上1min。7、加氯化钙（每50ml初始培养物用1ml氯化钙）重悬，加入DMSO轻轻混匀(每1ml感受态细胞悬液加入70ulDMSO)。8、感受态细胞分装（200μl/管），-80℃保存备用。9、用时取200μl感受态细胞于冰浴上融化。感受态细胞制备流程图：过夜菌1000ul加入100mlLB液体培养基37℃，2500r/min振荡培养3h转移至4个50ml聚丙烯离心管配平冰水浴10min培养物到0℃4℃，4100rpm，离心10min回收细胞弃上清液倒置于吸水纸上放置1min加入0.1mol/LCaCl2（每50ml用10mlCaCl2）悬浮细胞沉淀，冰上放30min，4℃，4100rpm，离心10min回收细胞弃上清液倒置于吸水纸上放置1min加入预冷0.1mol/LCaCl2（每50ml用10mlCaCl2），重悬加入DMSO轻轻混匀（每1ml悬液加70ulDMSO）分装（200ul/管）-80℃保存备用