实验细胞化学染色血细胞化学染色得基本要求就是在原位显示细胞成分和结构,反应产物应就是有色沉淀物,具有一定得稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。(一)固定固定有物理法与化学法,物理法为干燥和火焰固定,化学法最常用得就是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。(二)显示1、偶氮偶联法:利用人工合成得酶底物,在酶作用下,产生分解产物,再与重氮盐结合引起偶氮偶联,使其形成不溶性得偶氮色素,以此证明酶得存在。2、联苯胺法:粒细胞和单核细胞中得过氧化物酶作用于过氧化氢,释放新生态氧,使无色得联苯胺形成蓝色沉淀。3、普鲁士蓝法:细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用,形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4、雪夫反应:过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基,醛基与雪夫试剂作用,使无色品红形成红色沉淀。5、金属沉着法其她尚有物理学方法,如脂溶性染料染色(显示脂质)、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。(三)细胞化学定量粗略估量,以染色反应得强弱,受色得深浅,人为地区别为阴性和各种程度得阳性。百分法,只能反映细胞阳性率,不能反映受色强弱。积分法,就是常用得半定量法,将等级估量与百分率相结合她既反映了细胞阳性率得高低,又反映了细胞受色得强弱。下面介绍几种常用得细胞化学染色方法这些方法学在白血病得鉴别诊断上具有重要意义。一、过氧化物酶染色(POX)POX10【试剂】1%TMB亚硝基铁氰化钠饱和溶液1%过氧化氢溶液稀过氧化氢溶液瑞氏染色液【操作】1、取0、1%TMB乙醇溶液lml,加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μl,混合溶液呈淡棕黄色。2、在新鲜干燥得血片上,加混合溶液0、5ml,放置lmin后,再加稀过氧化氢溶液0、7ml,染色6min。3、瑞氏染液复染15～20min。4、油镜镜检。【结果】细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。(－)无颗粒沉着;(±)颗粒细小,分布稀疏;(+)颗粒较粗,局灶分布;(++)颗粒粗大,分布较密,占胞质1/2~2/3;(+++)颗粒粗大,呈团块分布;(++++)全部胞质均部满颗粒,可覆盖胞核。骨髓片POX染色【临床意义】(1)粒系:POX主要分布在粒细胞和单核细胞内,随着粒细胞成熟得程度而逐渐增强,中性分叶核粒细胞为强阳性。嗜酸性粒细胞阳性程度最强,其阳性颗粒比中性粒细胞粗大,有折光。碱性粒细胞为阴性。(2)单核细胞:原始单核细胞为阴性反应,幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应,颗粒细小,弥散分布。(3)其她细胞淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。(4)血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞得核膜上,可作为原巨核细胞得一种标志物,有助于FABM7得识别。(5)过氧化物酶染色主要用于鉴别急性白血病类型,急性髓细胞白血病多呈阳性反应,以M3和M2型反应最强,MI和M5型反应较弱,故有助于区别M3和M5型。急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应,故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别得重要指标。注意事项二、苏丹黑B染色【试剂】1、10%甲醛液。2、苏丹黑B乙醇溶液【操作】1、干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。2、自来水冲洗。3、放人染色液中,37℃染色30~60min。4、用70%乙醇脱色1~2min,水洗lmin。、5、瑞氏染液复染20~30min。【结果】脂类呈黑色或棕黑色颗粒,定位于细胞浆中(+)颗粒很小,细小、稀疏,或胞质局部面积得1/4有致密得颗粒。(++)颗粒较少,或胞质面积得1/2出现黑色颗粒。(+++)颗粒较密,或胞质面积得3/4出现黑色颗粒。(++++)颗粒极密,颗粒间无间隙。【临床意义】1、粒细胞系早幼粒及以下阶段随着细胞成熟,阳性颗粒逐渐增加。早期原粒细胞一般为阴性,少数细小点状颗粒代表线粒体被染色晚期原粒细胞可出现阳性颗粒,其颗粒限于胞浆得某一区域。2、单核细胞系阳性,颗粒细小,分布弥散,形状不规则。原单核细胞为阴性。3、红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应4、尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应。5、苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似,主要用于急性白血病类型得鉴别。苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感,但特异性不如过氧化物酶染色(极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性)。三、过碘酸一雪夫(PAS)染色【结果】(1)粒细胞系:原粒细胞多呈阴性反应,也可弱阳性。自早幼粒细胞以后随着细胞得成熟程度,阳性反应逐渐增强。嗜酸粒细胞颗粒本身不着色,但颗粒间得胞质呈弥漫性阳性反应;嗜碱粒细胞为阳性反应,颗粒紫红色,大小不一。中性粒细胞糖原含量参考标准(-)胞质无颗粒(+)胞质呈淡红色,无颗粒(++)胞质呈红色,有少量颗粒(+++)胞质呈暗红