原位杂交操作流程冰冻切片的（DIG-labeledRNAprobe）原位杂交操作程序一、切片制备用新鲜组织制作6μm厚冰冻切片，37℃干燥1～4小时，进行下一步操作。二、预杂交前处理预固定：4%PFA（inDEPC-PBSPh7.4）RT30～60min4%PFA：多聚甲醛20g1×PBS450ml加热（60℃、20min）溶解冷却后调pH至7.41×PBS→500mlPBSRT5min×210×PBS：500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47.7gDEPC水450ml调Ph至7.5DEPC水加至500mlPBS(含0.3%v/vTritonX-100)RT15min临用前配制10%TritonX-10015ml1×PBS→500mlPBSRT5min×2消化：2μg/mlProteinaseKinTEbuffer37℃10minTE：pH8.0Tris-HCl1M5mlpH8.0EDTA0.5M1mlDEPC水→500ml0.2%GlycininPBSRT5min×2(50xDenhart’s;Ficoll400聚蔗糖1g后固定：4%PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮1gBSA牛血清白蛋白1gDEPC水100ml）PBSRT3min×20.1M三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐RT5min×20.1M三乙醇胺：三乙醇胺2.64mlDEPC水200ml用前加入乙酸酐500μlPBSRT5min×2三、预杂交预杂交50℃2h预杂交液：50%去离子甲酰胺5×SSC5×Denhardt’s0.02%SDS0.1mg/mltRNA四、杂交杂交50℃12h以上五、杂交后处理2×SSC脱去盖膜（片）50℃2×SSC清洗37℃10min×220μg/mlRNaseAinRnsaebuffer37℃30minRnsaebuffer;2MTris5ml0.25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8.0DW→1000mlRnasebuffer37℃30min2×SSC50℃15min×21×SSC（含0.02%SDS）37℃15min×25%SDS2ml1×SSC500ml0.1×SSC37℃15min×2BufferⅠ37℃10min×2BufferⅠ:2MTris-HClPh7.625ml3MNaCl25mlD.W.→500ml封闭；0.5%抗体阻断液inBufferⅠ（含0.2%Tween20）37℃20min抗体阻断液:(1:500抗地高辛抗体in阻断液37℃2h)阻断剂1gTween-200.4mlBufferⅠ37℃10min×2BufferⅠ200mlBufferⅡ37℃10min×2显色；BufferⅡ:2MTris10ml（1:50NBT/BCIPStockSolutioninBufferⅡ2~24h）3MNaCl6.67mlMgCl22.033g（湿合、避光）D.W.180ml浓HCl调pH至9.5D.W.→200ml终止反应：BufferⅢRT5min×2流水冲洗5-10min1%甲基绿复染3-10min，水洗，晾干，封固大家应该也有点累了，稍作休息DNA探针检测石蜡切片中DNA组织标本试剂操作流程杂交前处理预杂交和杂交杂交后漂洗信号放大和显示结果判断ISH流程探针3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACCI酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19MCS侧面的SP6和T7RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lacZα-肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。4、利用Roche生产的体外转录标记RNAkit（Cat.No999644）操作流程参阅《原位检测技术》p132-133。组织细胞标本的准备ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理）操作流程7、预杂交0.2×SSC＋50％甲酰胺30min37℃。8、杂交：滴加杂交液（2μg/ml）加一层复盖膜，48℃杂交8-12h。9、杂交后洗：2×SSC洗2×5min45℃1×SSC洗2×5min室温0.5×SSC洗2×5min室温0.1×SSC洗2×5min室温PBS洗3×3min