GeneticEngineeringGeneticEngineering1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术A基因的结构特点基因表达操纵子学说第一节基因的结构特点基因:产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列,由结构基因和调节基因组成.结构基因:转录成各种RNA直接行使功能;转录成mRNA,翻译成功能蛋白质.调节基因:调节或限制其他基因活性的基因,如启动子,增强子,终止子等.一、原核生物基因结构特点DNA1)结构简练2)存在转录单元3)有重叠基因mRNA1)半衰期短2)以多顺反子形式存在3)存在SD序列二、真核生物基因结构特点DNA1)不连续性2)高度重复序列---卫星DNAmRNA1)5?帽子结构2)具ploy(A)尾3)单顺反子第二节基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，但并非所有基因表达过程都产生蛋白质，编码tRNA、rRNA基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。定义:一、原核生物基因表达转录与翻译几乎同时发生,表达调控主要发生在转录水平上.RNA聚合酶（RNApolymerase）的作用是转录RNA。原核生物RNA聚合酶有比较复杂的亚基结构。如大肠杆菌RNA聚合酶有四条多肽链，另有一个促进新RNA分子合成的σ因子，因此它的组成的是α2ββ’σ。这种结构称为全酶（holoenzyme）,除去了σ因子的酶称为核心酶。σ因子,识别DNA上的启动子,提高聚合酶与启动子的亲和力.二、真核生物基因表达第三节操纵子学说Jacob和Monod对大肠杆菌乳糖发酵过程酶的适应合成及一系列有关突变型进行深入研究,于1961年提出了乳糖操纵子模型,开创了基因表达调节机制研究的新领域.操纵子:基因表达的协调单位,有共同的控制区和调节系统.包括在功能上彼此有关的结构基因和控制部位.乳糖操纵子:阻遏子I启动子O操纵子P结构基因ZYA乳糖操纵子基因表达调控模型二、操纵子调节的类型1代谢产物对基因活性的调节正调节负调节2降解产物对基因活性的调节3环腺苷酸受体蛋白对转录的调控可诱导:乳糖操纵子可阻遏:色氨酸操纵子BDNA的提取与纯化电泳技术聚合酶链反应(PCR)技术核酸分子杂交DNA序列分析基因定点突变技术酵母双杂交系统第一节DNA的提取与纯化由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。一、质粒DNA的提取GenomicDNAplasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DN