蛋白质浓度测定方法很多，每种方法都有其自身的优点和缺点以及适用范围，不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白缓冲体系选择合适的测定方法。一、考马斯亮蓝法（bradford法）－在本实验室中主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋白浓度测定（一）实验原理考马斯亮蓝法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。/&BIe`bradford法的突出优点是：~G_Z~|（1）灵敏度高%w（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。（3）干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。zat此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。#（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂tritonx-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH。k%{n*（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材61.试剂：Q*H@::（1）标准蛋白质溶液，用G—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G—250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。SY0;.Rg2.器材：=A7zUjg（1）可见光分光光度计bZ!?4（2）旋涡混合器CV|h6-#（3）试管16支=HB!9（三）操作方法|O{!=r1.标准方法（要用96孔板进行实验，方法参照pierce公司试剂盒，此方法可以保留，但是要加96孔板实验方法）$t（1）取13支试管，1支作空白，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0(空白)、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。2U:X}（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂。NIS3*注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。H（3）另取O.1mL未知浓度的蛋白溶液同上测定cL!3(In?（4）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。NL9V@0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。{\?8Zk72.微量法xtiRuXj6R当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100ug/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。RGFU[B50.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。W0%x二、紫外吸收法N[1]HF1l}*优点：1紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。2低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。缺点：1测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨