基因工程工具酶一概述细菌的R-M体系：定义：限制-修饰体系，细菌可识别自身DNA和外源DNA，降解外源DNA—对外源DNA有抵抗力原理：修饰酶从SAM（s-腺苷甲硫氨酸）上转移甲基到特定识别位点的特定碱基上，使DNA甲基化，保证内源DNA不被限制酶降解生物意义：保证内源DNA不被限制酶降解，快速降解未被甲基化的外源DNA※DNA复制过程中的甲基化：模板链是甲基化的，使子代DNA（半甲基化）不被限制酶降解，甲基化酶再将新合成链甲基化，使子代DNA完全甲基化，防止被内切酶降解二限制性内切酶（限制酶）限制酶识别位点特征：专一性大多有4-8bp：主要是6bp的，富含CG大多为回文序列：反向重复序列,易切割出粘性末端片段切割位点在识别序列内：识别位点甲基化不利于切割※限制酶识别序列出现几率及酶切片段估算切割方式：成黏性末端：切割位点在识别序列中心轴两侧3’黏性末端：3’末端比5’长5’黏性末端：5’末端比3’长成平齐末端：切割位点在识别序列中心轴处※切割位点的标记：↓、/※同位酶、同裂酶与同尾酶同位酶：同裂酶：来源不同，但有相同的识别序列，切割DNA后产生相同末端的一组限制酶同尾酶：来源不同，识别序列也不同，但切割DNA后产生相同末端的一组限制酶酶活影响因素DNA纯度：杂质会降低酶活DNA甲基化：DNA甲基化后稳定，不易切割DNA分子结构：线性DNA易切，超螺旋难切；CG多难切星活性：酶的特异性改变而呈现的活性缓冲液：时间与温度：t=1-1.5h;T=37OC反应体积与甘油浓度：保存时50%甘油防冻融，反应时<50%；酶体积在总反应体积1/10以内，防酶活被抑制；反应体积：20-100ul※酶活单位定义：※三种限制酶三DNA连接酶分类T4DNA连接酶：可连接双链DNA片段的平齐末端、黏性末端大肠杆菌DNA连接酶：NAD+供能，只连接黏性末端反应条件：T：16oC原因：温度37OC最宜，但温度过高会氢键断裂缓冲液：Tris-HCl50-100mmol/L维持pH稳定MgCl2：10mmol/L，激活剂ATP：0.5-1PTT：5mmol/L，巯基试剂，防被氧化pH：7.5V：10-20uLt：4-16h※酶活单位：1IU=最适条件下，15oC反应1h，完全连接1ugλDNA所需酶量四DNA聚合酶（DNAPol）分类大肠杆菌DNAPolⅠ：三活性：5’→3’聚合，3’→5’外切，5’→3’外切※3’→5’外切：校正5’→3’外切：切除突变DNA、引物反应条件：应用：缺口平移制探针、3’-粘端的末端标记合成cDNA的第二链※切口移位法标记DNAKlenow：定义：DNAPolⅠ被木瓜蛋白酶水解成的2/3大亚基酶活：5’→3’聚合，3’→5’外切应用：随机引物标记核酸探针、5’-粘端补平或3’端标记、合成cDNA的第二链、DNA序列分析、3’-端的末端标记222324T4DNAPol：定义：T4噬菌体中发现的，可标记平齐末端的DNA聚合酶两活性：5’→3’聚合，3’→5’外切（对单链DNA作用更强）基因工程中的作用：平齐末端标记，3’末端隐蔽T7DNAPol：特点：持续合成能力最强酶活：5’→3’聚合，3’→5’外切应用：引物延伸、双脱氧终止法对长DNA测序反转录酶：基础知识：见分子生物学，以RNA为模板，生成无内含子的cDNA分类：AMV-逆转录酶：Mo-MLV-逆转录酶：应用：TaqDNAPol：耐高温：最适温度75℃~80℃，95℃可维持活性40min—用于PCR无3’→5’外切校正活性：PCR循环次数太多会导致DNA损伤积累激活剂：Mg2+，低浓度Mn2+中也有活性抑制剂：Ca2+反应条件Tris-HCl：维持pH7.5Mg2+：激活剂EDTA：使DNase去激活，防止DNA被水解五RNA聚合酶六其它DNA修饰酶核酸外切酶：S1核酸酶：降解ssDNA、ssRNA，对ssDNA活性高※作用：切ssDNA成平齐末端DNase/RNase：水解DNA、RNA，要用EDTA去激活，防止目的基因被水解※RNase分布广：操作时要带手套，防止引入RNase水解了目的RNA△RNase分类：RNaseA、T1、H▲DNase分类：Ⅰ、Ⅱ、ⅢT4多聚核苷酸激酶：末端脱氧核苷酸转移酶：※本章总结