口腔免疫研究方法免疫荧光技术酶联免疫吸附试验蛋白质印迹流式细胞术一、免疫荧光1.概述免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。2.基本原理间接免疫荧光法：间接法与间接ELISA相似，引入标记二抗，可以检测抗原，也可以检测抗体。优点：一抗可以结合多个标记二抗，固灵敏度比直接法高。缺点：比直接法易出现非特异荧光。免疫荧光原理示意图3.免疫荧光实验过程4.免疫荧光技术的相关应用②病原体检测③免疫病理检测5.口腔应用举例直接免疫荧光IgG上皮棘层呈翠绿色渔网状荧光细胞免疫荧光技术组织免疫荧光技术二、酶联免疫吸附试验1.ELISA的原理2.基本类型间接法检测特异性抗体优点:只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法操作简单迅捷缺点：可重复性差通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断双抗体夹心法检测可溶性抗原优点：待测抗原需要≥2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法；重复性较好；缺点：操作复杂，费时费力3.ELISA基本操作步骤4.ELISA数据处理5.结果判断定量实验1.标准品和待测样品的OD值减去空白孔的OD值2.绘制标准曲线，计算出待测样品浓度根据绘制的标准曲线以及待测样品的OD值可计算出待测样品浓度。6.口腔应用实例ELISA方法检测龈沟液中细胞因子（如IL-8/IL-4/TNF-α等）的浓度：将标本于冰箱内取出，室温解冻，4℃离心后取上清备用。利用检测试剂盒，ELISA检测龈沟液中细胞因子的浓度。用途：血清、血浆、细胞上清液、组织匀浆及相关液体样本中免疫炎性因子、抗原和抗体的检测。三、WesternBlot印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法2.WesternBlot基本原理Westernblot原理Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触343.WesternBlot操作流程常用仪器4.相关应用临床：在艾滋病病毒感染中，根据出现显色线条的位置可以判断有无针对病毒的特异性抗体，以此法作为确诊试验。使用印迹抗原来测定各种病人的抗体谱已经直接作为临床免疫检验的手段，被称之为确认试验的“金标准”。5.口腔应用实例取蛋白分别经10%SDS、5%PAGE凝胶电泳后，抗原转至NC膜。放入5%脱脂奶粉中封闭，PBS洗膜。加入一抗（鼠抗人MMP-28多克隆抗体）4℃过夜，洗涤后加入二抗（兔抗鼠IgG）37℃下孵育1h，DAB显色，PBST漂洗，密度扫描并拍照。对MMP-28表达与OLP临床参数进行相关性分析。为什么要作蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。四、流式细胞术1.流式细胞术概述流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。流式细胞仪台式机——FACSCalibur大型机——FACSVantageSE3.流式细胞仪主要构造FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）侧向角散射（SSC,SideScatter）4.流式细胞仪分析数据常见图形直方图（HistogramPlot）二维点阵图（DotPlot）5.常规检测时的样品制备直接免疫荧光标记的样品制备间接免疫荧光标记的样品制备DNA荧光染色的样品制备细胞凋亡检测样品的制备微量全血法免