会计学【实验原理】由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的相对分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白（如图3-5）。图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及γ-球蛋白，6为点样原点这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。【实验材料】1．电泳仪包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。2．醋酸纤维素薄膜。⑵试剂③透明液：临用前配制。甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。④保存液：液体石蜡。⑤定量洗脱液（溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。【实验方法与步骤】②电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。③电极槽的平衡用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。⑵点样图3-6醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）⑶电泳图3-7电泳装置剖视示意图1.纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板⑷染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）图3-8血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱比较示意图a.蛋白染色b.脂蛋白染色⑹结果判断与定量本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4N氢氧化钠4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波长用650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。光密度总和T＝A+α1＋α2＋β＋γ各部分蛋白质的分数为：A（清蛋白）%=A/T×100α1-球蛋白%=α1/T×100α2-球蛋白%=α2/T×100β-球蛋白%=β/T×100γ-球蛋白%=γ/T×100附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些理化性质．现将人血浆蛋白质的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。蛋白质名称备注【注意事项】⑵缓冲液的选择⑶加样量⑷电量的选择⑸染色液的选择⑹透明及保存【实验方法】1．准备与点样(1)将薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用硬铅笔划一点样线。(2)将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲中，使膜条自然浸湿。(3)将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条置洁净滤纸上。(4)用载玻片点样。2．电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极，槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5min后通电，电压为110V，电流为～0.6mA/cm，通电1h左右关闭电源。3．染色通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于氨基黑10B的染色液中，染5min取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。4．定量本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4mol/L氢氧化钠4ml，剪开薄膜上各条蛋白色