基础学习实验醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离Hb和cytC此实验共包括如下三个部分第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测Ezrin蛋白是食管癌细胞侵袭移动的重要蛋白；活性与非活性状态的Ezrin蛋白与F-actin的结合能力不一样，对细胞形态有重要影响甘露糖化修饰预测：O位糖基化修饰预测：豆蔻酰化位点预测：乙酰化位点预测：磷酸化位点预测：以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2.分析某种物质的纯度及分子量电泳的基本原理待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。血清蛋白醋酸纤维膜电泳各种电泳技术在临床检测分析方面有重要的作用+醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。实验操作及注意事项染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。定量：取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4NNaOH4ml；剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时；用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。甘露糖化修饰预测：过低，电泳时间增加，扩散。c.α1球蛋白％＝α1/T×100%α1球蛋白：2～5%蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。学习聚丙烯酰胺作为电泳介质的优点及用途立即用5ml注射器针头沿玻璃壁内侧面缓慢加入0.156000-300000蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度）第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。豆蔻酰化位点预测：临床意义聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳以聚丙烯酰胺作为支持物，两性载体电解质在支持物内形成稳定的pH梯度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当与自身pI的位置中聚合成一狭窄的区带而停留下来。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液，其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。引入电场时，载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移，在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处。实验操作及注意事项试剂2.电泳将已聚合的凝胶去除水层，凝胶端加2％氢氧化钠消除凹面，垂直插入电泳槽中的橡皮管中；在电泳槽