CELLECTISS.A.NASDAQ2015.11.18DNA剪切技术治疗1岁女童获成功基因组编辑技术简介GenomeEditing修改遗传信息的第一步：按我们的设计来重组DNA第一节基本概念重组DNA技术：是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。又称为分子克隆技术或基因工程技术第二节重组DNA技术的发展史基因工程的诞生第三节工具酶WernerArber理论预见限制酶Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列。①5`突出粘性末端②3`突出粘性末端③平头（钝性末端）5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：2、DNA连接酶3、DNA聚合酶（1）5’端标记（2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP能在1%SDS溶液中68℃加热15min而失活，故CIP较为常用。催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。第四节重组DNA技术常用载体是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。1、具备复制能力。2、具备一个或多个筛选标志。3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位点，MCS）。5、具有较高的遗传稳定性。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。1、质粒（plasmid）:pBR322质粒载体①相对分子质量小，长度为4.3kb。②含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。③有24种限制性内切酶位点。④有一个复制起始点（ori）及与DNA复制有关的序列，赋予该质粒复制子特性。⑤为松弛型复制子。是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。噬菌体生活周期284、病毒第五节重组DNA技术基本步骤1、制备目的基因（2）构建基因组DNA文库：(3)构建cDNA文库：(5)直接用限制性内切酶切取、分离：对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。2、克隆载体的选择和构建由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割形成互补的黏性末端。经退火后，由DNA连接酶连接。平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率,所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度比粘性末端连接要高些。（3）定向连接：（4）同聚物加尾连接：（5）人工接头连接：4、重组DNA导入受菌体5、重组体的筛选与鉴定（一）根据遗传表型进行筛选的方法（1）抗生素抗性筛选（2）β-半乳糖苷酶系统筛选（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法（1）抗生素抗性筛选:大多数载体均带有抗生素抗性基因(插入失活法)抗生素抗性筛选（2）β-半乳糖苷酶系统筛选48（1）分离：提取和获得目的基因和载体（2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切；（3）连接：目的基因与载体连接，形成新的重组DNA分子；（4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞；（5）筛选：筛选转化成功的细胞克隆（6）表达：培养获得外源基因的细胞或生物体，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。修改遗传信息的第二步：怎样将需要的信息导入到细胞？重组质粒DNA转化微生物电转化法的特点适用微生物多效率高死亡率高基因枪转化法的特点适用微生物较少效率较高革兰氏阳性菌的转化一般需要制备原生质体真菌的转化一般需要制备原生质体植物遗传转化方法和技术根癌农杆菌介导的植物转基因59基因枪介导法电转化法PEG转化法花粉管通道法动物遗传转化方法和技术原核显微注射法胚胎干细胞介导法病毒载体法1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基因重组/敲除的技术基础1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因重组/敲除的理论基础1987年，Thompssonetal首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善基因敲除的原理RNAi引起基因敲除的机制同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除适用范围：适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞;原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定